The mechanism of peptide exchange by mhc II molecules

76 
Chapter III 
4.2.2
 
Surface plasmon resonance experiments 
SPR  experiments  were  prepared  and  carried  out  as  described  in  3.2.5.  Chips  were 
regenerated  by  injection  of  either  HA  peptide  (50  µM)  or  MBP  peptide  (5  µM).  For 
experiments  at  different  temperatures  than  25 ºC  the  chip  was  again  normalized  after 
temperature  change.  Biotinylated  DM  wt  and  DM  mut  were  prepared  as  described  in 
3.2.1. Binding of the reference flow cell (DM mut) was subtracted from binding in the 
experimental flow cell (DM wt). 
 
4.2.3
 
Fluorescence polarization experiments 
Fluorescence  polarization  (FP)  experiments  were  conducted  on  a  Victor
3
  V 
multilabel  plate  reader  (PerkinElmer)  using  black  polystyrene  384-well  flat-bottomed 
plates  (Corning).  DR/peptide  complexes  were  incubated  with  MBP(85-99)  peptide 
which  was  labeled  at  position  P5  (lysine-to-cysteine  substitution)  with  a  maleimide 
derivative  of  Alexa  Fluor  488  (Molecular  Probes).  Measurements  were  performed  in 
triplicates in a volume of 40 µL in 50 mM citrate phosphate buffer (pH 5.3) containing 
150 mM NaCl.  
 
4.3
 
Results and discussion 
4.3.1
 
Preparing the high-affinity complexes HLA-DR2/MBP and HLA-DR1/HA 
The high-affinity complexes DR1/HA and DR2/MBP were prepared to be tested for 
DM binding in SPR experiments at different temperatures. HA peptide is a high-affinity 
influenza hemagglutinin peptide of amino acid 306-318. MBP peptide is part of myelin 
basic protein (residues 85-99) and has a high-affinity to DR2. DR2/MBP was produced 
in  Sf9  insect  cells  and  purified  using  affinity,  ion  exchange  and  gel  filtration 
chromatography. The linker between MBP peptide and DR was proteolytically cleaved. 
To prepare the high-affinity DR1/HA complex, DR1/CLIP was produced in CHO cells 
and  the  linker  between  peptide  and  DR  proteolytically  cleaved  after  affinity 
chromatography.  Following  the  peptide  exchange  protocol  described  in  4.2.1,  HA 
peptide was loaded onto DR1 molecules and DR1/HA further purified by gel filtration 
and affinity chromatography.  
 

---

77 
Chapter III 
4.3.2
 
Measuring  HLA-DM  binding  to  HLA-DR2/MBP  and  HLA-DR1/HA  using 
surface plasmon resonance 
Surface  plasmon  resonance  experiments  at  25 ºC  showed  only  little  DM  binding  to 
the high-affinity DR/peptide complexes DR2/MBP and DR1/HA (see figure 4.1, A, B). 
To  test  whether  DM  binding  to  the  high-affinity  complexes  is  enhanced  with  higher 
temperature  SPR  experiments  were  carried  out  at  37 ºC.  As  can  be  seen  in  figure  4.1 
(D) definitive DR2/MBP binding to DM was measured at 37 ºC with 69, 155 and 273 
response  units  for  10  μM,  20  μM  and  40  μM  DR2/MBP,  respectively.  DR1/HA  was 
injected at 10 μM, 20 μM and 40 μM, as well, at 37 ºC and DM binding of 13, 22 and 
39 response units was measured, respectively, (figure 4.1, C).  
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figure  4.1:  DM  binding  to  high-affinity  MHC II/peptide  complexes  at  25 ºC  and  37 ºC.  (A,  B) 
DR1/HA (10 µM) was injected for 7 minutes (A) and DR2/MBP (2 µM) for 5 minutes (B) at a flow rate 
of 15 µL/min at 25 ºC, followed by buffer injection (black arrow) and peptide injection (green arrow), 50 
µM  HA  peptide  (A)  and  10  µM  CLIP  peptide  (A),  respectively.  (C,  D)  At  37 ºC,  DR1/HA  (C)  and 
DR2/MBP (D), respectively,  were injected for 10 minutes at a flow rate of 15 μL/min at  10 μM (blue), 
20 μM (red) and 40 μM (green), followed by injection of buffer and injection of 50 μM HA peptide (C) or 
5 μM  MBP  peptide  (D).  (A-D)  SPR  assays  were  carried  out  in  consecutive  flow  cells  with  500  RU  of 
immobilized DM wt and DM mut, respectively, in citrate phosphate buffer (pH 5.3). Binding in the DM 
mut flow cell was subtracted from measurements in the DM wt flow cell.  (experiments in A and B were 
carried out by Anne-Kathrin Anders)
 

---

78 
Chapter III 
The  SPR  data  show  that  increased  DM  binding  to  high-affinity  MHC II/peptide 
complexes  is  detected  at  higher  temperature  suggesting  that  peptide  mobility  which  is 
increased at higher temperature may play an important role for DM binding. 
 
4.3.3
 
Comparing HLA-DM binding detected by surface plasmon resonance with 
HLA-DM catalysis measured by fluorescence polarization 
To  test  the  functional  relevance  of  the  DM  binding  assay  conducted  by  surface 
plasmon  resonance,  SPR  data  were  compared  with  fluorescence  polarization 
experiments  measuring  DM  catalysis.  Therefore,  DM  binding  and  DM  catalyzed 
peptide exchange of the low-affinity complex DR2/CLIP and the high-affinity complex 
DR2/MBP were measured and set in comparison. Comparing the initial binding rates of 
DM  binding  to  DR2/CLIP  and  DR2/MBP  measured  by  SPR,  8.7-fold  slower  DM 
binding was detected to DR2/MBP compared to DR2/CLIP (figure 4.2, A).  
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figure 4.2: Comparison of the kinetics of DM binding and DM catalysis for low-affinity versus 
high-affinity  DR/peptide  complexes.  (A)  DM  binding  by  low-affinity  (DR2/CLIP)  and  high-affinity 
complexes (DR2/MBP). DR2 complexes preloaded with the indicated peptides (10 µM) were injected for 
10 minutes followed by injection of buffer and 5 µM MBP peptide. The SPR experiments  were carried 
out in citrate phosphate buffer (pH 5.3) at 37 ºC at a flow rate of 15 µL/min in consecutive flow cells with 
500  RU  of  immobilized  DM  wt  and  DM  mut,  respectively.  Measurements  from  the  DM  mut  flow  cell 
were subtracted from data obtained from the DM  wt flow cell. DM binding by DR2/MBP was 8.7-fold 
slower  compared  to  DR2/CLIP,  based  on  measurements  of  the  initial  rates.  (B)  DM  catalyzed  peptide 
exchange of DR2/CLIP and  DR2/MBP complexes. Binding of 200 nM  Alexa488-labeled MBP to DR2 
(200 nM) preloaded with the indicated peptides was measured in the presence or absence of 100 nM DM 
in  50  mM  citrate  phosphate  buffer  (pH  5.3),  150  mM  NaCl.  The  initial  rate  of  DM  catalyzed  peptide-
binding was 11.8-fold slower when DR2/MBP rather than DR2/CLIP was used as the input protein in the 
reaction. 
 
 

---