The mechanism of peptide exchange by mhc II molecules

VI 
Summary 
observed including  a small divergence of the DRα and DRß  helices normally adjacent 
to the peptide N-terminus and an altered conformation of the conserved residue Valβ85 
which  partially  opens  up  the  P1  pocket.  Overall,  the  DR1  structure  seems  to  be 
relatively  stable  even  if  three  conserved  hydrogen  bonds  are  disrupted  and  small 
conformational  changes  appear  to  destabilize  the  P1  anchor,  which  may  facilitate 
peptide release. 
 
Peptide  mobility  in  the  MHC II  peptide-binding  groove  was  further  investigated  in 
this  study  by  NMR  experiments  and  revealed  the  presence  of  multiple  conformations 
for  MBP  (myelin  basic  protein)  peptide  bound  to  DR2  molecule.  These  data  advance 
the  structural  understanding  of  MHC II/peptide  complexes  which  is  so  far  mainly 
deduced from the static picture of crystal structures of MHC II/peptide complexes. The 
NMR approach, including biosynthetic production of isotope-labeled MBP peptide and 
subsequent loading onto DR2 molecules, resulted in high-quality NMR spectra and can 
be  used  to  further  explore  details  about  peptide  dynamics  in  the  MHC II/peptide 
complex.  
 
During  this  work,  the  established  NMR  system  was  applied  to  investigate  peptide 
release catalyzed by the small molecule J10 in solution. Although comparison of NMR 
data  before  and  after  J10  addition  revealed  subtle  changes  in  peak  intensities,  which 
could indicate that the small molecule induces one of the peptide conformations, further 
experiments are necessary to confirm this effect. The 
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F-NMR experiments performed 
in  this  study  revealed  a  higher  affinity  of  the  small  molecule  to  low-stability 
MHC II/peptide  complexes  than  to  high-stability  complexes.  This  finding  could  direct 
co-crystallization approaches of the small molecule that aim to identify its binding site 
on MHC II molecules, which could in turn be important for further improvement of the 
function of the therapeutically interesting J10. 
 
 

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VII 
Zusammenfassung 
Zusammenfassung 
 
Präsentation 
antigener 
Peptide 
durch 
Klasse 
II 
Moleküle 
des 
Haupthistokompatibilitätskomplexes (major  histocompatibility complex, MHC) auf der 
Zelloberfläche  ist  entscheidend  für  den  Ablauf  der  adaptiven  Immunantwort,  die 
Prozesse 
wie 
Antikörperproduktion, 
Zellzerstörung 
und 
Initiierung 
von 
Regulationsmechanismen  beinhaltet.  Die  Peptidbeladung  und  Ausbildung  von  stabilen 
Peptid-MHC-Klasse-II-Komplexen  wird  katalysiert  von  HLA-DM  (DM),  ein 
untypisches MHC-Klasse-II-Molekül. Ein Schwerpunkt dieser Doktorarbeit war es, den 
molekularen  Mechanismus  des  von  DM  katalysierten  Peptidaustausches  besser  zu 
verstehen,  welches  Bemühungen  vorantreiben  könnte,  die  Immunogenität  bekannter 
und  neuer  pathogener  Organismen  vorherzusagen.  Desweiteren  wurde  der  von  einem 
kleinen  Molekül  beschleunigte  Peptidaustausch  von  MHC-Klasse-II-Molekülen 
untersucht.  Das  synthetisch  hergestellte  kleine  Molekül  namens  J10  hat  Potential 
therapeutisch  angewandt  zu  werden,  da  es  ermöglichen  könnte,  aktiv  das  präsentierte 
Peptidrepertoire zu verändern, welches von Interesse ist für mannigfaltige medizinische 
Anwendungen, wie z.B. verbesserte Effizienz von peptidbasierten Impfstoffen. Um den 
dynamischen Prozess des Peptidaustausches zu untersuchen, welcher das Unterbrechen 
und  Wiederausbilden  von  vielfachen  Peptid-MHC-Klasse-II  Interaktionen  beinhaltet, 
wurden  unterschiedliche  Methoden  angewandt,  wie  Röntgenkristallographie,  NMR 
Spektroskopie und Oberflächenplasmonresonanz.  
 
Oberflächenplasmonresonanzexperimente  in  der  Doktorarbeit  demonstrieren,  dass 
DM an die stabilen Peptid-MHC-Klasse-II  Komplexe DR1/HA und DR2/MBP bindet, 
welche bis dahin keine oder nur geringe Empfindlickeit gegenüber DM gezeigt hatten. 
Diese  Ergebnisse  unterstützen  das  Model  eines  gemeinsamen  Übergangszustandes  für 
Peptid-MHC-Klasse-II  Komplexe  mit  hoher  und  geringer  Affinität,  welcher  abhängig 
ist  von  kinetischen  Parametern  und  bei  höherer  Temperatur  häufiger  vorkommt. 
Desweiteren  wurde  in  dieser  Arbeit  die  funktionelle  Bedeutung  von  den 
Oberflächenplasmonresonanzexperimenten  demonstriert,  indem  DM  Bindung  und  DM 
katalysierter  Peptidaustausch  von  zwei  Peptid-MHC-Klasse-II  Komplexen  mit  hoher 
und  geringer  Affinität  verglichen  wurden.  DM  Aktivität  wurde  mit  Hilfe  von 
Fluoreszenzpolarisation  gemessen  und  die  Resultate  beider  Methoden  zeigten  gute 
Übereinstimmung.  

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VIII 
Zusammenfassung 
Vorherige  Studien  haben  gezeigt,  dass  die  Loslösung  des  Peptid-N-Terminus 
entscheidend  ist,  damit  DM  an  MHC-Klasse-II  Moleküle  bindet,  was  wahrscheinlich 
durch  spontane  Peptidbewegung  möglich  ist  und  auch  durch  SPR  und  NMR  Daten  in 
dieser Arbeit unterstützt wird. Die Auswirkungen der partiellen Peptidloslösung auf die 
MHC-Klasse-II  Struktur  waren  jedoch  unbekannt.  In  dieser  Doktorarbeit  wird  die 
Kristallstruktur  eines  DR1  Moleküls  präsentiert,  welches  mit  einer  Variante  des  HA 
(hemagglutinin)  Peptids  ohne  die  zwei  N-terminalen  Aminosäuren  beladen  ist  und 
somit  einen  Übergangszustand  während  der  Peptidloslösung  von  MHC-Klasse-II 
Molekülen  darstellt.  Erstaunlicher  Weise  weist  die  Struktur  keine  grossen,  sondern 
kleine konformationelle Unterschiede auf, wie z.B. ein geringes Auseinandergehen der 
DRα und DRß-Ketten, die sich normalerweise neben dem Peptid-N-Terminus befinden, 
und  eine  veränderte  Seitenkettenkonformation  von  Valβ85,  was  zu  einer  teilweisen 
Ӧ ffnung der P1 Tasche führt. Im Allgemeinen scheint die DR1 Struktur relativ stabil zu 
sein,  auch  wenn  drei  konservierte  Wasserstoffbrücken  unterbrochen  sind.  Geringe 
konformationelle  Veränderungen  scheinen  die  P1  Bindungstasche  zu  destabilisieren, 
was eventuell die Peptidloslösung erleichtert.  
 
Darueberhinaus  wurde  in  dieser  Arbeit  die  Peptidmobilität  in  der  Bindungstasche 
von Peptid-MHC-Klasse-II Komplexen mit NMR Experimenten untersucht welche die 
Anwesenheit mehrerer  Konformationen  für das  MBP (myelin basic  protein)  Peptid im 
Komplex  mit  DR2  zeigten.  Diese  Daten  geben  ein  besseres  strukturelles  Verständnis 
des  Peptid-MHC-Klasse-II  Komplexes,  welches  bisher  vor  allem  durch  das  statische 
Bild  von  Kristallstrukturen  beeinflusst  ist.  Der  NMR  Ansatz,  welcher  die 
biosynthetische  Produktion  von  isotopen-markiertem  MBP  Peptid  und  anschliessender 
Beladung von DR2 Molekülen beinhaltet, ergab qualitativ hochwertige NMR Spektren 
und  kann  angewandt  werden,  um  weitere  Details  der  Peptiddynamik  in  der 
Bindungstasche zu untersuchen.  
 
Das  oben  beschriebene  NMR  System  wurde  während  dieser  Arbeit  angewandt,  um 
die  von  dem  kleinen  Molekül  J10  katalysierte  Loslösung  des  Peptids  in  Lösung  zu 
untersuchen. Obwohl der Vergleich von NMR Daten vor und nach J10 Zugabe geringe 
Unterschiede  von  Signalintensitäten  zeigte,  welches  bedeuten  könnte,  dass  J10  eine 
bestimmte  Peptidkonformation  induziert,  sind  weitere  Experimente  erforderlich,  um 
diesen Effekt zu bestätigen. 
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F-NMR Experimente in dieser Arbeit zeigten höhere J10 

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