The mechanism of peptide exchange by mhc II molecules

64 
Chapter II 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figure  3.9:  C-terminus  of  adjacent  DR1  molecule  binds  further  away  than  N-terminal  part  of 
full length HA peptide binds to DR1. The rotated conformer of Valβ85 was also observed for the DR1 
molecule,  which  exhibits  a  peptide-binding  site  that  interacts  with  a  C-terminus  of  an  adjacent  DR1 
molecule.  As  the  C-terminus  binds  further  away  than  the  peptide  N-terminus  the  tight  interactions 
between  peptide  and  MHC II  molecule  are  not  imitated.  In  green  as  cartoon  representation,  DRα 
(background) and DRβ chain (foreground) can be seen of DR1/HA(P
1,Val
-P
11
) forming part of the peptide-
binding groove.  Residue  Valβ85 is shown as  stick  model. The  previously published DR1/HA structure 
(1DLH) was superimposed and the full length HA peptide and residue Valβ85 are shown as yellow stick 
representation.  In  blue  as  stick  representation  the  DRα  C-terminus  of  the  adjacent  DR1  molecule  of 
DR1/HA(P
1,Val
-P
11
) can be seen.  
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figure  3.10:  Comparison  of  the  DR1  peptide-binding  groove  carrying  an  N-terminally 
truncated HA(P
1,Val
-P
11
) peptide and a CLIP(106-120) peptide missing P-2. The new DR1/HA(P
1,Val
-
P
11
) structure (green) is superimposed with the previously published DR1 structure carrying a CLIP(106-
120) peptide (3PGD, yellow). The helices of the DRα and ß chains adjacent to the peptide N-terminus are 
further apart in the DR1/HA(P
1,Val
-P
11
) structure and the altered conformer of Valß85 is not observed for 
the DR1/CLIP(106-120) structure. DR1 molecules and peptides are shown as cartoon representation and 
relevant DR residues are indicated and represented as stick model.  
 

---

65 
Chapter II 
3.3.6
 
Eluting  N-terminally  truncated  HA  peptide  from  HLA-DR1  protein  used 
for crystallization and analyzing by mass spectrometry 
The  peptide  stock  solution,  used  to  prepare  the  crystallized  DR1/peptide  complex, 
was  analyzed  to  investigate  whether  a  peptide  contaminant  derived  from  peptide 
synthesis  exhibited  an  additional  valine  at  position  P1  seen  in  the  electron  density 
(3.3.5).  Therefore,  the  peptide  solution  was  analyzed  by  mass  spectrometry  in 
combination  with  liquid  chromatography  and  individual  peptide  sequences  were 
determined  by  identifying  resulting  peptide  fragments.  Indeed  a  minor  peptide 
component  was  found  that  included  an  additional  valine  at  position  P1 
(VVKQNCLKLATK) besides the primary peptide with sequence VKQNCLKLATK.  
To  further  investigate  whether  the  peptide  contaminant  also  bound  to  DR1,  bound 
peptide  was  eluted  from  DR1  protein  used  for  crystallization.  Under  reducing 
conditions  the  covalently  linked  peptide  was  released  from  DR1  and  as  the  peptide 
carried  a  C-terminal  DNP-label  the  peptide  was  separated  from  protein  using  α-DNP 
affinity chromatography. The eluted peptide sample was analyzed by mass spectrometry 
and the peptide contaminant was detected in addition to the primary peptide species. As 
can  be  seen  in  the  mass  spectrum  in  figure  3.11,  the  particular  peptide  contaminant 
carrying a valine at P1 position was even enriched on DR1 after peptide loading likely 
due to the higher affinity to DR1 compared to the primary peptide missing a P1 anchor.  
Therefore,  DR1  protein  used  for  crystallization  contained  both  peptide  species  and 
DR1  carrying  the  peptide  contaminant  including  a  P1  anchor  might  have  crystallized 
preferentially as it presumably exhibits higher stability. 
 
 

---

66 
Chapter II 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figure 3.11: Mass spectra of a synthesized HA peptide variant prior to DR1 binding and eluted 
from DR1 protein used for crystallization (inset). Mass spectrum of a sample of the stock solution of 
synthesized N-terminally truncated HA peptide used for loading DR1 molecules. The main peak at 1412 
Da  corresponds  to  the  main  peptide  species,  an  HA  peptide  variant  missing  residues  P-2,  P-1  and  P1 
(VKQNCLKLATK-DNP).  A  minor  peak  at  1511  Da  can  be  seen  representing  an  HA  peptide  variant 
missing residues P-2, P-1 and containing an additional valine at P1 position (VVKQNCLKLATK-DNP). 
Inset:  The  covalently  linked  HA  peptide  variants  were  eluted  from  DR1  molecules  under  reducing 
conditions.  An  enrichment  of  the  HA  peptide  variant  with  a  mass  of  1510  Da  is  observed.  High 
background signal can be seen due to low peptide concentration.  
 

---

67 
Chapter II 
3.3.7
 
Measuring  HLA-DR  binding  to  N-terminally  truncated  HLA-DM  using 
surface plasmon resonance 
As  one  of  the  two  peptide-binding  sites  in  the  structure  of  DR1/HA(P
1,Val
-P
11
) 
interacts with the flexible C-terminus of an adjacent DR1 molecule (3.3.5), the question 
was raised whether the N-terminus of the DMα chain might bind to DR in a similar way 
and could be involved in peptide exchange. The N-terminus is present on the outer face 
of DM and could reach the DM/DR binding site. Therefore, eleven residues of the DMα 
chain  were  truncated  and  DR  binding  assays  were  performed  using  surface  plasmon 
resonance. However, as can be seen in figure 3.12, the truncated DM bound as well as 
the unmodified DM molecule to DR1 carrying a low-affinity CLIP peptide. Therefore, 
the possibility can be excluded that the N-terminus of the DMα chain is involved in DR 
binding.  
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figure  3.12:  Measuring  DR  binding  to  N-terminally  truncated  DM  using  surface  plasmon 
resonance. In consecutive flow cells 500 RU of DM mutant (αR98A, αR194A), DM with N-terminally 
truncated  α  chain  and  DM  wild  type,  respectively,  were  immobilized  and  DR1/CLIP
low
  (2  µM,  V8 
cleaved)  injected  for  four  minutes  at  a  flow  rate  of  15  μL/min.  After  buffer  injection  full  length  HA 
peptide (50 µM) was injected. The experiments were carried out in 50 mM citrate phosphate buffer (pH 
5.3), 150 mM NaCl at 25 ºC. The green line displays DR binding to truncated DM (third flow cell) and 
the  red  line  DR  binding  to  DM  wild  type  (fourth  flow  cell).  DR  binding  in  the  second  flow  cell  (DM 
mutant)  was  subtracted  from  measurements  in  the  third  (DM  with  N-terminally  truncated  α  chain)  or 
fourth flow cell (DM wt), respectively. The DR solution consecutively passed through flow chambers one 
to four, which can be also the reason why less DR binding was observed for flow cell four.  
 

---