The mechanism of peptide exchange by mhc II molecules

68 
Chapter II 
3.3.8
 
Measuring HLA-DM binding to HLA-DR1 carrying an HA peptide variant 
with a valine at P1 position and two N-terminal peptide residues absent 
As  the  DR1/peptide  complex  used  for  SPR  (figure  3.3)  and  crystallization 
experiments  (figure 3.4)  contained two HA peptide variants,  one missing a P1 residue 
and  the  other  one  containing  a  valine  at  P1  position,  shown  by  mass  spectrometry 
(figure 3.11), it had to be determined whether both or only one of the complexes bind to 
DM.  Previous  experiments  (Anders  et  al.,  2011)  had  shown  that  if  the  DR1  molecule 
carried an HA peptide variant missing two N-terminal residues and contained a tyrosine 
at  P1  position,  no  DM  binding  was  observed.  The  question  was  whether  DM  binding 
could  be  detected  with  a  DR1/peptide  complex  including  a  smaller  anchor  residue  as 
valine. Therefore, DR1/peptide complexes were prepared with synthesized HA peptide 
variants missing residues P-2, P-1 and one peptide specifically containing a valine at P1 
position  and  another  one  containing  a  glycine  at  P2  position  and  no  P1  residue.  Both 
complexes were used to carry out SPR experiments. The HA peptide with a glycine at 
position P2 (P-2, P-1, P1 missing) was synthesized by a different company and highly 
purified  after  synthesis  to  avoid  contaminations.  A  glycine  was  chosen  for  the  P2 
position  to  ensure  that  even  if  a  by-product  of  the  peptide  synthesis  would  include  an 
additional glycine at position P1 it would not represent an anchor residue.  
As  can  be  seen  in  figure  3.13  DM  binding  was  observed  for  the  DR1  complex 
carrying  an  HA  peptide  missing  two  N-terminal  peptide  residues  and  containing  a 
valine  at  P1  position  although  significantly  less  than  for  the  previously  used  DR1 
complex  containing  a  mixture  of  HA(P
1,Val
-P
11
)  and  HA(P
2
-P
11
)  peptides.  More  DM 
binding than to the previously used DR1 complex was observed with the DR1/peptide 
complex carrying an HA peptide with a glycine at P2 position and most probably no P1 
residue.  In  figure  3.13  (B)  it  can  be  seen  that  DM  binding  to  the  DR1/complex 
containing an HA peptide with a valine at P1 position (HA(P
1,Val
-P
11
)) is concentration 
dependent.  Interestingly,  the  off-rate  of  DR1/HA(P
1,Val
-P
11
)  is  slower  compared  to  the 
off-rates  of  DR1/HA(P
2
-P
11
)  and  DR1/HA(P
2,Gly
-P
11
)  which  could  indicate  that  the 
valine at P1 position may stabilize a DR conformer that binds to DM.  
 

---

69 
Chapter II 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
  
  
C 
 
 
 
 
 
 
Figure  3.13:  Measuring  DM  binding  of  DR1  molecules  carrying  various  HA  peptide  variants 
using surface plasmon resonance. (A) DR1 molecules (2 uM) were injected carrying various covalently 
bound  HA  peptide  variants,  full  length  HA  peptide  (pink),  HA(P
1,Val
-P
11
)  (blue),  mixture  of  HA(P
2
-P
11
) 
and  HA(P
1,Val
-P
11
)  (green),  HA(P
2,Gly
-P
11
)  (red).  (B)  DR1  with  covalently  linked  HA(P
1,Val
-P
11
)  peptide 
was injected at various concentrations, 2 µM (blue), 4 µM (red) and 10 µM (green). (A, B) DR1/peptide 
complexes  were  injected  for  5  minutes  with  a  flow  rate  of  15  µL/min  following  buffer  injection  for  5 
minutes  and  injection  of  full  length  HA  peptide  (50  µM).  The  experiments  were  carried  out  in  50  mM 
citrate  phosphate  buffer  (pH  5.3),  150  mM  NaCl  at  25 ºC.  Binding  in  the  DM  mutant  flow  cell  was 
subtracted  from  measurements  in  the  DM  wild  type  flow  cell.  The  table  in  (C)  shows  the  peptide 
sequences  and  a  description  of  the  different  HA  peptide  variants.  The  position  of  the  P1  anchor  is 
underlined. 
 
3.3.9
 
Measuring  HLA-DM  binding  to  HLA-DR1  mutant  (Valß85Asp)  using 
surface plasmon resonance  
As described in  3.3.5 the crystal  structure of DR1/HA(P
1,Val
-P
11
)  revealed no major 
conformational  changes  although  the  two  N-terminal  peptide  residues  were  missing. 
However,  as  a  consequence  of  the  absent  peptide  residues,  DR  residues  that  normally 
make contact with the peptide N-terminus became exposed. These residues are alanine 
52  and  serine  53  of  the  DRα  chain  and  valine  85  and  histidine  81  of  the  DRß  chain 
(figure  3.14).  As  release  of  the  peptide  N-terminus  is  crucial  (Anders  et  al.,  2011)  for 
DM  binding,  DM  may  bind  in  the  DR  region  where  normally  the  peptide  N-terminus 
binds  and  make  contact  to  some  of  the  newly  exposed  DR  residues,  which  could 
stabilize  the  region.  To  test  this  hypothesis  residue  Valß85,  which  is  usually  buried 
 
sequence 
description 
HA 
PKYVKQNCLKLAT 
full length 
HA(P
1,Val
-P
11
) 
VVKQNCLKLAT 
P-2, P-1 missing, Val at P1 position 
HA(P
2
-P
11
) 
VKQNCLKLAT 
P-2, P-1, P1 missing 
HA(P
2,Gly
-P
11
) 
GKQNCLKLAT 
P-2, P-1, P1 missing, Gly at P2 position 

---