The mechanism of peptide exchange by mhc II molecules

70 
Chapter II 
under  the  peptide  N-terminus  (residues  P-2,  P-1),  was  mutated  to  aspartic  acid 
introducing a charged residue at that site. DM binding of the DR1 mutant was compared 
to DM binding of the DR1 wild type using surface plasmon resonance. Both molecules 
carried a covalently linked HA peptide missing residues P-2, P-1, P1 and containing a 
glycine at position P2 to ensure the respective DR1 region is exposed.  
As can be seen in figure 3.15 less DM binding was observed for DR1 mutant than for 
DR1 wild type indicating DM binding occurred more slowly for the mutant than for the 
wild type. However, the off-rate of the mutant was also slower than the off-rate of the 
wild type making it difficult to determine whether the overall affinity of the mutant is 
lower. More mutations in the respective DR region have to be tested for DM binding to 
further investigate this hypothesis  
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figure 3.14: DR1 residues become accessible once the two N-terminal peptide residues (P-2, P-1) 
are  absent.  The  DR1  residues  Serα53,  Alaα52,  Hisß81  and  Valß85,  which  are  covered  by  peptide 
residues  in  the  complex  of  DR1  with  full-length  HA-peptide,  (A)  become  exposed  once  the  two  N-
terminal  peptide  residues  (P-2,  P-1)  are  absent  (B).  Peptide  N-termini  with  part  of  the  peptide-binding 
groove of DR1/HA (1DLH) (A) and  DR1/HA(P
1,Val
-P
11
) (B) are shown. (C) Model showing an aspartic 
acid residue at position 85 of DRß chain.  (A, B, C)  DR  molecules are shown as cartoon depictions and 
peptides are shown as surface representations. 
 

---

71 
Chapter II 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figure 3.15: Comparing DM binding of DR1 wild type and DR1 mutant with residue Valß85 
mutated to aspartic acid. DR1 wild type and DR1 mutant (Valß85Asp) carrying HA(P
2,Gly
-P
11
) peptide 
were injected at 1 µM. As can be seen DR1 mutant (red) binds to DM with a slower on-rate and a slower 
off-rate than DR1 wild type (blue). DR1/peptide complexes were injected for 5 minutes with a flow rate 
of 15 µL/min following buffer injection for 5 minutes and injection of full length HA peptide (50 uM). 
The experiments  were carried out in 50  mM citrate phosphate buffer (pH 5.3), 150 mM  NaCl at 25 ºC. 
Binding in the flow cell of DM mutant was subtracted from measurements in the DM wild type flow cell. 
 
3.4
 
Conclusion 
To determine the co-crystal structure of DR and DM co-crystallization experiments 
were set  up with  a modified DR1/peptide  complex carrying  an N-terminally truncated 
HA  peptide,  which  showed  higher  affinity  to  DM  than  DR  molecules  carrying  full 
length peptides. To determine conditions favoring crystallization of the non-covalently 
linked  DR/DM  complex  versus  the  individual  proteins,  the  affinity  of  the  DR/DM 
complex  was  measured  at  different  pH  applying  surface  plasmon  resonance.  The 
experiments revealed that the pH optimum for DM/DR binding is around pH 5.5 and a 
major drop in DM binding was observed between pH 6.5 and pH 7.0 with dissociation 
constants  of  4.7  μM  and  15.4  μM,  respectively.  The  results  agree  with  previous  data 
measuring increased DM activity at acidic pH present in the late endosome (Sloan et al., 
1995) where DM catalysis happens. Therefore, crystallization experiments were set up 
using customized crystallization conditions with pH lower than 6.5.  
Unfortunately, the DM/DR complex did not crystallize, however, the DR1 molecule 
with  an  N-terminally  truncated  HA  peptide  yielded  crystals  which  revealed  a  DR1 
structure (2.14 Å resolution) carrying a peptide missing two N-terminal peptide residues 
(P-2, P-1) and containing an additional valine at position P1. That the peptide included a 
0
100
200
300
400
500
600
0
25
50
75
100
C1091/SP120 (1 uM)
C930/SP120 (1 uM)
time (s)
RU

---

72 
Chapter II 
P1  residue  was  surprising  as  a  synthesized  HA  peptide  variant  was  used  for  the 
preparation of the DR/peptide complex lacking all three N-terminal peptide residues. As 
was confirmed later by mass spectrometry, a side-product of the peptide synthesis likely 
bound  to  DR1  carrying  an  additional  valine  at  P1  position.  The  minor  species  was 
probably  enriched  due  to  two  selection  processes,  i.e.  preferential  binding  during  the 
peptide loading step based on higher peptide affinity and favored crystallization based 
on higher stability of the DR/peptide complex. SPR experiments revealed that the DR1 
complex carrying an HA peptide variant with a valine at P1 position and two N-terminal 
peptide residues missing binds to DM, although the extent of DM binding is lower than 
that of DR1/peptide complex lacking a P1 anchor. Previously DR1 with an HA peptide 
variant  containing  a  tyrosine  as  P1  anchor  (P-2, P-1  missing)  displayed  only  marginal 
binding to DM; however, it seems that the presence of valine at P1 position allows DM 
binding maybe due to its smaller size. Alternatively the valine may more readily leave 
the  pocket  due  to  fewer  interactions  with  the  pocket  in  case  DM  binding  requires  an 
empty P1 pocket to bind DR. That even a full length peptide bound to a DR molecule 
exhibits extensive mobility has been observed during the studies described in chapter I. 
The  inhomogeneity  of  the  DR1/peptide  complex  carrying  at  least  two  different  HA 
peptide variants may have made it more difficult to crystallize the DR/DM complex, as 
DM also exhibits lower affinity to the DR/peptide complex containing a P1 anchor.  
The DR1 crystal structure revealed an interesting crystal contact with the flexible C-
terminus of the DRα chain binding to the empty part of the peptide-binding groove of a 
neighboring  DR1  molecule  demonstrating  the  affinity  of  this  region  for  extended 
peptide  strands  and  protruding  protein  parts.  The  resulting  hypothesis  that  DM  may 
bind  to  DR  in  a  similar  way  with  the  solvent  exposed  N-terminus  of  the  DMα  chain 
possibly  reaching  the  DM/DR  interface  was  excluded  by  SPR  experiments  in  these 
studies.  
Surprisingly,  no  major  conformational  change  of  DR1  was  observed  as  had  been 
expected  due  to  loss  of  DR/peptide  interactions  and  lack  of  three  conserved  hydrogen 
bonds.  However,  smaller  conformational  changes  were  observed.  First,  the  helices  of 
the DRα and ß chains normally next to the peptide N-terminus were further apart than in 
the  DR1  structure  carrying  a  full  length  HA  peptide  (Stern  et  al.,  1994)  or  a  CLIP 
peptide  missing  residue  P-2  (Gunther  et  al.,  2010).  The  divergence  of  the  helices  is 
likely  due  to  the  missing  interactions  with  the  peptide  in  between  them  normally 
holding  the  helices  closer  together.  Although  the  DR1  structure  can  not  directly  be 

---