The mechanism of peptide exchange by mhc II molecules

73 
Chapter II 
compared  with  the  molecular  dynamics  simulations  that  were  carried  out  with  DR1 
molecules  lacking  the  entire  peptide  (Painter  et  al.,  2008;  Rupp  et  al.,  2011),  the 
observations  are  different  as  a  small  divergence  and  not  a  narrowing  or  partially 
collapsing  of  the  helices  around  the  peptide  N-terminus  was  observed.  However,  it  is 
also possible that a larger part of the peptide has to be absent for collapse of the groove.  
Furthermore,  a  small  conformational  change  of  residue  valine  β85  was  observed 
which  is  a  conserved  residue  forming  part  of  the  P1  pocket  and  exhibits  a  conserved 
rotamer. In the presented structure Valβ85 is rotated outwards opening up part of the P1 
pocket, which probably further destabilizes the P1 residue and may facilitate release of 
the entire peptide.  The altered rotamer of Valß85 was  not  observed for the DR1/CLIP 
structure  missing  residue  P-2  (Gunther  et  al.,  2010)  and  may  be  dependent  on  the 
absence of residue P-1.  
The  absence  of  two  N-terminal  peptide  residues  led  to  exposure  of  DR  residues 
(Alaα52, Serα53, Hisβ81 and Valβ85) that are normally covered by or in  contact with 
the  peptide,  raising  the  question  whether  DM  may  interact  with  these  newly  exposed 
DR  residues  and  may  bind  to  the  DR  region  normally  covered  by  the  peptide  N-
terminus.  To  test  this  hypothesis  residue  Valβ85,  which  is  usually  covered  by  peptide 
residue  P-1,  was  mutated  to  an  aspartic  acid  introducing  a  charged  residue  and  SPR 
experiments  revealed  a slower on-rate, but  also  slower off-rate  for DM binding of the 
DR mutant compared to DR wild type. To further investigate this hypothesis more SPR 
experiments with different mutations in the respective DR region need to be carried out. 
Summarizing, we can say that if the two N-terminal peptide residues are missing (P-2, 
P-1) and with it three conserved hydrogen bonds between peptide N-terminus and DR, 
no  major  conformational  change  of  the  peptide-binding  groove  is  observed.  Whether 
DM binds to the newly exposed DR region and whether release of the P1 anchor residue 
induces a major conformational change of the DR molecule still has to be determined. 
However, the presented DR1 structure carrying an HA peptide missing two N-terminal 
peptide residues reveals a relevant intermediate state during peptide release contributing 
to a detailed understanding of peptide exchange by MHC II molecules.  
 
 

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74 
Chapter III 
4
 
Chapter  III:  Investigating  HLA-DM  binding  to  high-
affinity MHC II/peptide complexes  
4.1
 
Introduction 
DM  plays  an  important  role  as  peptide  editor  of  MHC II  molecules  ensuring  the 
generation 
of 
high-stability 
MHC II/peptide 
complexes. 
The 
presence 
of 
MHC II/peptide  complexes  with  a  long  half-life  on  the  cell  surface  is  important  for 
multiple  T  cell  encounters  and  potential  antigen  recognition.  Previous  studies  have 
shown  that  low-stability  complexes  are  good  substrates  for  DM-mediated  peptide 
release  whereas  high-stability  complexes  are  poor  substrates  with  some  high-affinity 
complexes  believed  to  be  DM  insensitive  (Kropshofer  et  al.,  1996).  For  example, 
DR1/HA  was  believed  to  be  resistant  to  DM  action  as  no  DM-facilitated  peptide 
exchange could be observed (Kropshofer et al., 1996; Sloan et al., 1995). Experiments 
carried out in our lab using an N-terminally truncated peptide revealed that DM binds to 
a  MHC II  conformer  with  a  critical  part  of  the  binding  groove  empty  (Anders  et  al., 
2011).  These  novel  data  suggested  that  spontaneous  release  of  the  peptide  N-terminus 
may  be  required  for  initial  DM  binding  and  also  implied  that  in  contrast  to  previous 
assumptions DM theoretically should bind to any MHC II/peptide complex, even if to a 
small extent, as peptide motion is always present.  
It had been shown before that peptide exchange in the presence or absence of DM is 
dependent on both temperature and pH (Denzin and Cresswell, 1995; Reay et al., 1992; 
Sloan et al., 1995). Furthermore, previous data revealed that dissociation of the peptide 
N-terminus  represents  a  crucial  component  of  the  energy  barrier  which  has  to  be 
overcome explaining the strong temperature dependence of DM binding (Anders et al., 
2011).  To test  whether  DM binding to  high-stability MHC II/peptide complexes  could 
be enhanced by  higher temperature  also  increasing peptide mobility, SPR experiments 
were carried out  at 25 ºC and 37 ºC. The SPR experiments at 37 ºC were substantially 
more  challenging  than  experiments  at  room  temperature  and  had  to  be  carried  out 
carefully as the machine used for measuring surface plasmon resonance is very sensitive 
and high temperature, for example, can cause spontaneous bubble formation in the flow 
chambers.  

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75 
Chapter III 
Additionally,  to  test  the  functional  relevance  of  the  DM  binding  assay  carried  out 
using  surface  plasmon  resonance,  data  obtained  by  SPR  were  compared  to  functional 
experiments  measuring  DM  catalyzed  peptide  exchange  by  fluorescence  polarization. 
For  this  purpose,  DM  binding  to  a  low-  and  a  high-affinity  DR/peptide  complex  was 
measured by SPR and compared to DM catalyzed peptide exchange of both complexes 
monitored by fluorescence polarization.  
 
4.2
 
Materials and Methods 
4.2.1
 
Preparation of HLA-DR/peptide complexes 
Soluble DR1/CLIP complexes were produced using stably transfected CHO cells in 
hollow  fiber  bioreactors  (Day  et  al.,  2003)  and  purified  by  affinity  chromatography 
(L243, American Type Culture Collection). Aggregates were removed by gel filtration 
(Superose  6,  GE  Healthcare)  and  the  linker  between  peptide  and  N-terminus  of  DRβ 
chain cleaved with thrombin (20 units thrombin/mg protein, 1.5 h, 25 °C). HA(306-318) 
peptide was synthesized by Peptide 2.0 with a DNP label linked to a lysine group at the 
peptide  C-terminus.  For  peptide  exchange  DR1/CLIP  was  incubated  (30  ºC,  8  hours) 
with 50 µM HA peptide and 50 µM J10-1 in 50 mM citrate phosphate buffer (pH 5.3), 
150  mM  NaCl  at  a  protein  concentration  of  0.3  mg/mL  including  protease  inhibitors. 
Unbound  peptide  was  removed  by  gel  filtration  (Superose  12,  GE  Healthcare)  and 
DR1/HA further purified by anti-DNP chromatography.  
DR2/MBP  and  DR2/CLIP  were  expressed  in  Sf9  insect  cells  after  infection  with 
recombinant  Baculovirus  (MOI  >  5,  pAcDB3  plasmid  with  BaculoGold  Baculovirus; 
BD  Biosciences).  Proteins  were  purified  by  affinity  chromatography  (L243,  American 
Type  Culture  Collection)  and  the  linker  between  peptide  and  DRß  chain  cleaved  with 
thrombin  (20  units  thrombin/mg  protein,  1.5  h,  25 °C).  The  complexes  were  further 
purified  by  ion  exchange  chromatography  (MonoQ,  GE  Healthcare)  and  aggregates 
were  removed  by  gel  filtration  (Superose  6,  GE  Healthcare).  Purified  proteins  were 
buffer  exchanged  to  the  final  buffer  for  SPR  experiments  (50  mM  citrate  phosphate 
buffer, pH 5.3, 150 mM NaCl, 0.06 % C
12
E
9
 detergent). 
 

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