The mechanism of peptide exchange by mhc II molecules

82 
Final discussion and outlook 
conformer present  in  solution  which may  be exposed  after further peptide release, e.g. 
release  of  the  P1  anchor.  That  peptide-binding  induces  conformational  changes  of 
MHC II  molecules  has  been  observed  before  (Zarutskie  et  al.,  1999)  and  also 
indications of alterations in the P1 pocket (Chou and Sadegh-Nasseri, 2000). Recently, a 
structure was  published of a DR1  mutant  carrying a full  length  CLIP peptide  showing 
increased  susceptibility  to  DM  and  revealing  conformational  alterations  near  the  N-
terminus of the bound peptide involving a reorientation of a  helical region of the DRα 
chain for one of the two molecules in the asymmetric unit (Painter et al., 2011). Similar 
as  discussed  above  the  problem  exists  not  knowing  whether  the  crystallized  DR  form 
with  the  bound  peptide  binds  to  DM  or  whether  part  of  the  peptide  first  leaves  the 
binding  groove  before  DM  binding  occurs.  As  the  mutation  alters  the  P1  pocket  and 
thereby destabilizes the bound peptide apparent by an increased intrinsic rate of peptide 
release (Painter et al., 2011) enhanced DM susceptibility could be also partially due to 
increased  peptide  mobility.  To  further  address  the  receptive  MHC II  conformation 
which  seems  to  be  challenging  to  crystallize  due  to  its  short-lived  state  and  potential 
structural  diversity  other  methods  might  be  necessary  like  NMR  spectroscopy  to 
investigate  the  dynamic  state  of  the  complex  in  solution.  For  example,  the  system 
established  during  this  study  involving  isotope  labeled  peptide  bound  to  MHC II 
molecule can be further developed and used to track the bound peptide N-terminus upon 
DM  binding  in  solution.  In  addition,  further  crystallization  experiments  should  be 
performed with a DR1 molecule carrying an N-terminally truncated HA peptide variant 
with  a  glycine  at  P2  position  and  no  P1  anchor  residue  which  showed  enhanced  DM 
binding during this study and could reveal whether conformational changes occur once 
the P1 anchor is absent.  
The  co-crystallization  experiments  of  DR2  with  the  small  molecule  J10,  a  MHC 
loading enhancer, carried out in this study may involve a similar challenge as the small 
molecule  may  bind  to  and  stabilize  a  different  DR  conformation  than  the  form  that 
crystallized.  Functional  experiments  in  this  study  already  revealed  a  higher  affinity  of 
the  small  molecule  to  low-stability  MHC II/peptide  complexes  and  co-crystallization 
experiments  should  be  repeated  with  a  low-affinity  DR/peptide  complex.  Especially, 
DR complexes with N-terminally truncated peptides should be analyzed for J10 binding 
and  used  for  co-crystallization  experiments  as  the  small  molecule  may  function  by 
stabilizing the empty peptide-binding groove and a partially empty groove may expose 

---

83 
Final discussion and outlook 
a potential binding site. Dipeptides, another group of MLE, for example, showed some 
evidence for binding in the P1 pocket (Gupta et al., 2008).  
In general, investigating the mechanism of peptide exchange of MHC II molecules is 
very challenging as it involves breaking and reforming of tight interactions between the 
bound  peptide  and  MHC II  which  probably  involves  multiple  intermediate  states.  As 
peptide exchange is a dynamic process methods investigating protein dynamics should 
be  explored  besides  X-ray  crystallography.  For  example,  NMR  spectroscopy  could  be 
used to track peptide release and binding in solution as proposed above to gain insight 
into  the  dynamics  of  the  process.  X-ray  crystallography,  however,  can  provide 
important information about structural details of the process and the crystal structure of 
the  MHC II/DM  complex  could  display  how  MHC II  and  DM  interact  and  reveal 
important  details  about  the  peptide  exchange  mechanism.  However,  so  far  it  has  been 
not  possible  to  crystallize  the  MHC II/DM  complex  which  is  maybe  also  due  to 
structural  diversity  of  both  molecules.  DM  exhibits  highest  affinity  to  empty  DR 
molecules  (Anders  et  al.,  2011)  but  as  empty  MHC II  molecules  themselves  are  not 
stable  and  as  even  a  partial  empty  peptide-binding  groove  attracts  and  binds  extended 
protein  parts  (as  has  been  shown  in  this  study  by  a  prominent  crystal  contact)  an 
approach  based  on  empty  DR  molecules  may  introduce  inhomogeneity  which  could 
interfere  with  crystallization.  A  MHC II  molecule  with  a  covalently  linked  peptide 
which  is  N-terminally  truncated  provides  a  highly  receptive  DR  form  for  the  DR/DM 
complex  without  exposing  an  empty  peptide-binding  groove  that  may  bind  various 
contaminants.  Therefore,  the  DR1  molecule  carrying  an  HA  peptide  variant  with  a 
glycine at P2 position (missing residues P-2, P-1 and P1) which showed enhanced DM 
binding  during  this  study  could  provide  a  new  approach  for  crystallizing  the  DR/DM 
complex.  To  favor  crystallization  of  the  complex  further  studies  could  also  explore 
covalent linkage between both molecules.  
 
 

---

84 
References 
6
 
References 
 
Adams,  P.D.,  Afonine,  P.V.,  Bunkoczi,  G.,  Chen,  V.B.,  Davis,  I.W.,  Echols,  N.,  Headd,  J.J., 
Hung,  L.W.,  Kapral,  G.J.,  Grosse-Kunstleve,  R.W.,  et  al.  (2010).  PHENIX:  a  comprehensive 
Python-based  system  for  macromolecular  structure  solution.  Acta  Crystallogr  D  Biol 
Crystallogr 66, 213-221. 
 
Anders,  A.K.,  Call,  M.J.,  Schulze,  M.S.,  Fowler,  K.D.,  Schubert,  D.A.,  Seth,  N.P.,  Sundberg, 
E.J., and Wucherpfennig, K.W. (2011). HLA-DM captures partially empty HLA-DR molecules 
for catalyzed removal of peptide. Nat Immunol 12, 54-61. 
 
Anderson, K.S., and Cresswell, P. (1994). A role for calnexin (IP90) in the assembly of class II 
MHC molecules. EMBO J 13, 675-682. 
 
Bartels, C., Xia, T.H., Billeter, M., Güntert, P., and Wüthrich, K. (1995). The program XEASY 
for computer-supported  NMR  spectral  analysis  of  biological  macromolecules. J.  Biomolecular 
NMR 5, 1-10. 
 
Behrens, G.M., Li, M., Davey, G.M., Allison, J., Flavell, R.A., Carbone, F.R., and Heath, W.R. 
(2004).  Helper  requirements  for  generation  of  effector  CTL  to  islet  beta  cell  antigens.  J 
Immunol 172, 5420-5426. 
 
Belmares, M.P., Busch, R., Wucherpfennig, K.W., McConnell, H.M., and Mellins, E.D. (2002). 
Structural  factors  contributing  to  DM  susceptibility  of  MHC  class  II/peptide  complexes.  J 
Immunol 169, 5109-5117. 
 
Brown, J.H., Jardetzky, T.S., Gorga, J.C., Stern, L.J., Urban, R.G., Strominger, J.L., and Wiley, 
D.C. (1993). Three-dimensional structure of the human class II histocompatibility antigen HLA-
DR1. Nature 364, 33-39. 
 
Brunger,  A.T.  (1992).  Free  R  value:  a  novel  statistical  quantity  for  assessing  the  accuracy  of 
crystal structures. Nature 355, 472-475. 
 
Brunger, A.T. (2007). Version 1.2 of the Crystallography and NMR system. Nat Protoc 2, 2728-
2733. 
 
Brunger,  A.T.,  Adams,  P.D.,  Clore,  G.M.,  DeLano,  W.L.,  Gros,  P.,  Grosse-Kunstleve,  R.W., 
Jiang,  J.S.,  Kuszewski,  J.,  Nilges,  M.,  Pannu,  N.S.,  et  al.  (1998).  Crystallography  &  NMR 
system:  A  new  software  suite  for  macromolecular  structure  determination.  Acta  Crystallogr  D 
Biol Crystallogr 54, 905-921. 
 
Busch,  R.,  Pashine,  A.,  Garcia,  K.C.,  and  Mellins,  E.D.  (2002).  Stabilization  of  soluble,  low-
affinity HLA-DM/HLA-DR1 complexes by leucine zippers. J Immunol Methods 263, 111-121. 
 
Busch,  R.,  Reich,  Z.,  Zaller,  D.M.,  Sloan,  V.,  and  Mellins,  E.D.  (1998).  Secondary  structure 
composition  and  pH-dependent  conformational  changes  of  soluble  recombinant  HLA-DM.  J 
Biol Chem 273, 27557-27564. 
 
Call,  M.J.  (2011).  Small  molecule  modulators  of  MHC  class  II  antigen  presentation: 
Mechanistic insights and implications for therapeutic application. Mol Immunol 48, 1735-1743. 
 

---