The mechanism of peptide exchange by mhc II molecules

54 
Chapter II 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figure 3.3: Measuring affinity of DM to DR1 carrying an N-terminally truncated HA peptide at 
different  pH  using  surface  plasmon  resonance.  (A-E)  DM  and  DM  mutant  (αR98A,  αR194A)  were 
immobilized in consecutive flow cells of streptavidin chips. DR1 carrying an N-terminally truncated HA 
peptide variant was injected for five minutes at the indicated concentrations at 25 ºC in citrate phosphate 
buffer with the indicated pH. After protein injection, buffer with the indicated pH was injected to measure 
dissociation. Binding in the DM mutant flow cell was subtracted from measurements in the DM wild type 
flow  cell.  Dissociation  constants  were  determined  by  curve  fitting  using  1:1  Langmuir  model  (black 
curves). The table in (F) shows the calculated dissociation constants at different pH. 
 

---

55 
Chapter II 
3.3.3
 
Crystallizing  HLA-DR1  carrying  a  truncated  HA  peptide,  in  the  presence 
of HLA-DM and alone 
For  co-crystallization  experiments  purified  DM  and  DR1  carrying  an  N-terminally 
truncated  HA  peptide  were  mixed  at  a  1  to  1  ratio  and  concentrated  to  a  total 
concentration of ~ 10 mg/mL. As SPR experiments showed strongest DM affinity to the 
covalent  DR1/peptide  complex  at  acidic  pH  (see  3.3.2),  a  sparse  matrix  screen 
containing  conditions  with  pH  lower  than  6.5  was  prepared.  Around  480  initial 
crystallization conditions were screened.  
Of  the  initial  screens  two  crystallization  conditions  were  of  further  interest,  one 
containing  ammonium  sulfate  and  DMSO,  the  other  one  sodium  acetate  and  PEG 
10,000.  However  both  conditions,  although  set  up  with  a  DM/DR1  mixture,  yielded 
only  DR1  crystals.  The  ammonium  sulfate  condition  looked  very  promising  as  initial 
crystallization  drops  already  resulted  in  small  but  single  protein  crystals.  The  crystals 
were  further  optimized  and  in  the  end  reached  a  size  of  200  µm  x  80  µm  x  80  µm. 
However, as will be described in the next paragraph, data obtained from crystals grown 
in this condition were difficult to analyze due to crystallographic problems. Therefore, 
the second crystallization condition was pursued as well. 
The  sodium  acetate  condition  initially  yielded  only  fine  needles.  However,  upon 
optimization by varying pH and the concentration of the precipitant, longer and thicker 
needle/rod-shaped crystals were obtained with dimensions of up to 700 µm x 70 µm x 
50 µm. 
 
A
 
 
 
 
    
B
 
 
            
C
 
 
 
 
 
 
Figure  3.4:  Crystals  of  DR1  carrying  an  N-terminally  truncated  HA  peptide.  (A)  DR1  crystals 
were grown in 2.5 M ammonium sulfate and 10 % DMSO at 20 ºC. The dimensions of the crystals were 
200  µm  x  80  µm  x  80  µm.  (B+C)  DR1  crystals  were  grown  in  100  mM  sodium  acetate  (pH  4.3), 9  % 
PEG 10,000 at 20 ºC. The largest crystals had dimensions of 700 µm x 70 µm x 50 µm.  
 

---

56 
Chapter II 
3.3.4
 
Solving the structure of HLA-DR1 carrying an N-terminally truncated HA 
peptide 
DR1  crystals  obtained  with  the  ammonium  sulfate  condition  were  measured  by  X-
ray  synchrotron  radiation  and  diffracted  up  to  3.1  Å.  Indexing  of  the  diffraction  data 
revealed  that  the  DR1  molecules  crystallized  in  a  hexagonal  lattice.  However, 
determining  the  unit  cell  was  not  straight  forward  as  the  data  could  be  indexed  in  a 
small  (a  =  b  =  118  Å,  c  =  359  Å)  and  a  large  unit  cell  (a  =  b  =  204  Å,  c  =  359  Å) 
indicating pseudo-translation, which was further confirmed by the presence of a strong 
off-origin  peak  in  the  native  Patterson  map.  The  structure  was  finally  solved  by 
molecular replacement, but potential twinning made it difficult to definitively determine 
the space group and refine the structure. The R
free
 factor was stalled at ~ 32 % and for 
some  parts  of  the  molecule  it  was  difficult  to  unambiguously  interpret  the  electron 
density. 
Because  of  these  crystallographic  problems  crystals  of  another  crystallization 
condition were pursued containing sodium acetate. The needle/rod-shaped crystals were 
stepwise  exposed  to  synchrotron  radiation  to  minimize  radiation  damage  and  several 
complete data sets were collected from single crystals with a resolution of up to 2.14 Å 
(table 2.1). The DR1 protein crystallized in a monoclinic lattice with space group C222
1
 
and cell dimensions were unambiguously determined (a = 96 Å, b = 111 Å, c = 211 Å). 
Applying  molecular  replacement,  the  structure  was  solved  and  two  molecules  were 
found  in  the  asymmetric  unit.  No  indications  of  pseudo-translation  or  twinning  were 
detected  and  the  structure  was  refined  without  involvement  of  crystallographic 
problems.  In  the  end  an  R
work
  factor  of  20.8  %  and  an  R
free
  factor  of  23.5  %  were 
reached.  
 
 

---

57 
Chapter II 
Table 3.1: Data collection and refinement statistics of DR1 carrying an N-terminally truncated 
HA peptide.  The data set  was collected at beamline 23-ID-D at GM/CA-CAT at the  Advanced Photon 
Source of the Argonne National Laboratory, IL, USA. The crystal was grown in 100 mM sodium acetate 
(pH  4.3)  and  9  %  PEG  10,000  at  20 ºC  and  its  dimensions  were  700  µm  x  70  µm  x  50  µm.  Values  in 
parenthesis refer to the highest resolution shell.
 
 
Data collection 
 
Space group 
C222
1
 
Cell dimensions 
 
a, b, c (Å) 
95.8, 111.4, 211.4 
Resolution (Å) 
50.0-2.14 (2.18-2.14) 
R
merge
 (%) 
8.4 (34.4) 
I/σI 
31.7 (5.4) 
Completeness (%) 
94.6 (90.6) 
Redundancy 
6.4 (6.2) 
Refinement 
 
Resolution (Å) 
38-2.14 
No. unique reflections 
59393 (2862) 
R
work
/R
free
 (%) 
20.8/23.5 
Number of atoms (ASU) 
 
Protein 
6159 
Peptide 
159 
Water 
362 
B-factors (Å
2
) 
 
Protein 
35.0 
Peptide 
40.3 
Water 
38.1 
R.m.s. deviations 
 
Bond lengths (Å) 
0.007 
Bonds angles (º) 
1.055 
 
3.3.5
 
Structure of HLA-DR1 carrying an N-terminally truncated HA peptide 
Using  molecular  replacement  the  structure  of  DR1  carrying  an  N-terminally 
truncated HA peptide was solved to 2.14 Å resolution. The two DR1 molecules found in 
the asymmetric unit exhibit similar protein conformations with different crystal contacts 
with  one  crystal  contact  being  of  particular  interest.  As  can  be  seen  in  figure  3.5,  the 
flexible  C-terminus  of  the  DRα  chain  of  a  DR1  molecule  binds  to  the  partially  empty 
peptide-binding  groove  of  an  adjacent  DR1  molecule  where  normally  the  peptide  N-
terminus  is  bound.  This  intermolecular  contact,  which  occupies  only  one  of  the  two 
peptide-binding  grooves  in  the  asymmetric  unit,  is  stabilized  by  hydrogen  bonds 
between  the  DRα  C-terminus  and  conserved  MHC II  residues.  The  same  MHC II 
residues  are  involved  in  the  conserved  hydrogen  bond  network  between  peptide  N-
terminus and MHC II molecule. For example Hisβ81, which generally interacts with the 
peptide backbone of residue P-1, builds a hydrogen bond to  the carboxyl  group of the 
DRα C-terminus. Furthermore, the side chain of residue Serα53 forms a hydrogen bond 

---