The mechanism of peptide exchange by mhc II molecules

51 
Chapter II 
molecular  replacement  with  the  program  Phaser  (McCoy  et  al.,  2007)  using  the 
previously  solved  DR1/HA  structure  (PDB:  1DLH,  (Stern  et  al.,  1994))  as  a  search 
model. The structure was  refined using Phenix  (Adams  et  al.,  2010) and evaluation  of 
the  structure  was  carried  out  with  MolProbity  (Chen  et  al.,  2010).  During  refinement 
manual  adjustments  of  the  structure  were  performed  using  the  software  Coot  (Emsley 
and  Cowtan,  2004).  To  assess  the  accuracy  of  the  crystal  structure  the  statistical 
quantities  R
free
  and  R
work
  were  used  (Brunger,  1992).  Figures  depicting  protein 
structures are generated with PYMOL (Schrodinger, 2010).  
 
3.2.7
 
Eluting covalently linked peptide from HLA-DR1 
To release the covalently linked peptide from DR1 the complex was incubated for 1 
hour at 25 ºC in the presence of 4 mM DTT. After addition of full length HA peptide, 
using twenty times molar excess, the complex was incubated at 25 ºC for an additional 
hour. The sample was injected to an α-DNP affinity column and the separated peptide 
carrying  a  DNP-label  eluted  with  50  mM  CAPS  buffer  (pH  11.5).  The  eluted  peptide 
was lyophilized, dissolved in water and submitted for mass spectrometry.  
 
3.2.8
 
Mass spectrometry 
Lyophilized  peptide  sample  was  dissolved  in  water  and  separated  by  a  nano-liquid 
chromatography  system  (Nano-Acquity  UPLC  system  from  Waters  Corporation)  and 
analyzed  by  an  ABI  model  4800  TOF/TOF  Matrix  Assisted  Laser  Desorption  mass 
spectrometer and by a Thermo Scientific LTQ Orbitrap XL (Thermo Fisher Scientific).  
 
3.3
 
Results and discussion 
3.3.1
 
Preparing HLA-DM and HLA-DR1 carrying a truncated HA peptide, both 
used for crystallization experiments 
DM  used  for  crystallization  experiments  was  expressed  in  CHO  cells  and  purified 
following  the  scheme  described  in  figure  3.1.  First,  DM  was  purified  by  affinity 
chromatography and protein tags were proteolytically removed. After incubation under 
reducing conditions, free cysteines of DM were alkylated using iodoacetamide. DM was 
further purified by gel filtration and ion exchange chromatography before mixing with 

---

52 
Chapter II 
DR1  protein.  DR1  molecules  carrying  covalently  linked  HA  peptide  variants  were 
prepared  as  described  in  figure  3.2.  Initially,  DR1  molecules  carrying  a  low-affinity 
CLIP  peptide  were  expressed  in  Sf9  insect  cells  and  purified  by  affinity 
chromatography.  Aggregates  were  removed  by  gel  filtration  and  the  linker  between 
peptide  and  DRβ  chain,  as  well  as  C-terminal  leucine  zippers,  were  proteolytically 
cleaved.  DR1/CLIP
low
  was  further  purified  by  ion  exchange  chromatography.  As  for 
protein  crystallization,  large  amounts  of  covalently  linked  DR1/peptide  complex  are 
required,  the  peptide  exchange  protocol  had  to  be  improved  as  the  yield  amounted  to 
only  5  %.  By  using  a  milder  reducing  agent  (glutathione  instead  of  DTT),  balancing 
redox  conditions  and  longer  incubation  times  favoring  the  formation  of  the  disulfide 
bond between DR1 and peptide, the yield of the peptide exchange step was improved up 
to  30  %.  Following  the  optimized  peptide  exchange  protocol  described  in  3.2.1,  the 
low-affinity CLIP peptide was exchanged versus an N-terminally truncated HA peptide. 
After  peptide  exchange  under  redox  conditions  excess  peptide  was  removed  by  gel 
filtration.  By  improving  the  yield  of  the  peptide  exchange  reaction  it  was  feasible  to 
prepare enough protein for crystallization experiments. In the end the covalently linked 
MHC II/peptide complex was purified by ion exchange chromatography and the overall 
yield was ~ 8 %.  
 
expression in CHO cells (bioreactor) 
 
 
protein C-affinity chromatography 
 
 
 
thrombin digestion 
 
 
incubation under reducing conditions 
 
 
dialysis in the presence of iodoacetamide 
 
 
gel filtration  
 
 
ion exchange chromatography (MonoQ) 
 
 
Figure  3.1:  Preparation  of  DM  used  for  crystallization  trials.  DM  was  expressed  in  CHO  cells 
using hollow fiber bioreactors. After protein purification using protein C-affinity chromatography protein 
tags  were  removed  by  thrombin  digestion.  Following  incubation  under  reducing  conditions  DM  was 
dialyzed  in  the  presence  of  iodoacetamide  to  alkylate  free  cysteines.  DM  was  further  purified  by  gel 
filtration and ion exchange chromatography. 
 

---

53 
Chapter II 
 
expression of DR1/CLIP
low
 (SKARMATGALAQA) in Sf9 insect cells 
 
 
affinity chromatography (L243) 
 
 
 
gel filtration 
 
 
V8 cleavage 
 
 
ion exchange c hromatography (MonoQ) 
 
 
loading of HA peptide variant (P-2, P-1, P1 missing) under redox conditions 
 
 
gel filtration 
 
 
affinity chromatography (α-DNP) 
 
 
ion exchange chromatography (MonoQ) 
 
 
Figure  3.2:  Preparation  of  DR1  carrying  an  N-terminally  truncated  HA  peptide.  DR1/CLIP
low
 
was  expressed  in  Sf9  insect  cells  as  a  secreted  protein.  The  protein  was  purified  by  L243  affinity 
chromatography  and  aggregates  removed  by  gel  filtration  chromatography.  The  linker  between  peptide 
and DRβ chain as well as C-terminal leucine zippers were cleaved by V8 protease. After ion exchange 
chromatography the cleaved peptide was exchanged versus an HA peptide variant missing residues P-2, 
P-1 and P1 under redox conditions. Excess peptide was removed by gel filtration and the DR1 complex 
carrying  a  covalently  linked  HA  peptide  variant  further  purified  by  affinity  chromatography  and  ion 
exchange chromatography.  
 
3.3.2
 
Measuring pH-dependent affinity of HLA-DM to HLA-DR1 carrying an N-
terminally truncated HA peptide using surface plasmon resonance 
To determine optimal conditions for crystallizing the non-covalently linked complex 
of DM and DR1,  surface plasmon resonance experiments  were carried out  at  different 
pH. As can be seen in figure 3.3 the strongest affinity of DM to the covalent complex of 
DR1  and  an  N-terminally  truncated  HA  peptide  was  measured  at  pH  5.5  with  a 
dissociation  constant  of  ~  1.6  µM.  With  increasing  pH,  DM  affinity  decreased  with  a 
dissociation  constant  of  4.7  μM  at  pH  6.5  and  15.4  µM  at  neutral  pH.  To  favor 
crystallization of the non-covalent complex of  DM and DR1 crystallization conditions 
with pH lower than 6.5 were preferentially screened.  

---