Moleküler dünyadaki hızlı gelişmeler, enzim biyoteknolojisi ve sanayi alanlarındaki üretim çeşitliliği, bilim insanını yeni araştırmalara sürüklemektedir
Yüklə 354,88 Kb.
|
- Bu səhifədəki naviqasiya:
- B.stearothermophilus
- Geobacillus Bacillus
- 4. SONUÇLAR VE ÖNERİLER
|
3. 2 Tartışma Günümüzde, mikrobiyal dünyada, her geçen gün yeni türler izole edilmekte ve tanımlanmaktadır ve yaşam sürdükçe, yeni türler araştırılmaya devam edecektir. Hala tanımlanmayan pek çok tür olduğu düşünülürse, bakteriyal ekoloji hakkında bilinenler oldukça azdır ve yeni enzimatik fonksiyonlara veya yeni ürünlere sahip, özelleşmiş türler bulunabileceğine dair birçok tahminde bulunulmaktadır. Bu yüzden, mikrobiyoloji içerisinde, bakteriyal tanı oldukça ilgi görmekte ve gelişmektedir. Bakterilerin tanısında ve sınıflandırılmasında çeşitli metotlar kullanılmaktadır. Bunlar, kültürel, morfolojik, fizyolojik, biyokimyasal ve inhibitör testler, serolojik, kemotaksonomik, genotipik ve filogenetik çalışmalardır. Bu kategoriler ve içerdikleri karakterler Çizelge 4’de özetlenmiştir. Carl R. Woese ve arkadaşlarının, prokaryotların filogenisini 16S rRNA yöntemi ile araştırmaya başladıkları 1970’ lerden bu yana, bu konu ile ilgili bilgiler oldukça artmıştır. 16S rRNA yaklaşımını kullanarak, yaşamın belli başlı 3 branşa bölünebileceğini göstermişlerdir. Bu branşlar, günümüzde, Archea, Bacteria ve Eucarya domainleri olarak isimlendirilmektedir. (Önceden archebacteria, eubacteria ve eucaryotlar olarak bilinmekteydi). Bacteria içerisinde günümüze kadar birçok major soy çizgisi filogenetik olarak tanımlanmıştır (Busse H.J. et al., 1996). Bakteriyal sistematikte, birçok biyokimyasal, beslenmeyle ilgili ve fizyolojik karakterizasyon testleri geliştirilmiştir. Örneğin İndol testi, oksidasyon-fermentasyon, sitokrom oksidaz, katalaz, aminopeptidaz, KOH testi.
Genelde bu testler, katı ve/veya sıvı ortamlarda yapılmaktadır. Bu testlerin genelde standardize edilmesi ve yorumlanması zor olmakta ve nispeten daha çok zaman gerektirmektedir. Bununla birlikte, bu tip geleneksel testler, taksonların betimlenmesinde önemli olmaya devam etmektedir (Busse H.J. et al., 1996). Bu araştırmada ise, sıcak su kaynaklarından izole edilen termofilik bakterilerin tanısı amaçlanmıştır. Bu amaçla, izolatların kültürel, morfolojik, biyokimyasal ve fizyolojik özellikleri araştırılmıştır. Elde edilen sonuçlar, mevcut literatür bilgileriyle karşılaştırılarak, izolatların tür tanıları yapılmaya çalışılmıştır. Günümüzde, termofilik, aerobik, spor oluşturan ve optimal gelişme sıcaklıkları 45-70 C (veya 70 C’den fazla) olan bakteriler, çeşitli genuslar içerisinde sınıflandırılmaktadır. Bunlar, Bacillus, Alicyclobacillus, Brevibacillus, Aneurinibacillus, Sulfobacillus, Thermoactinomyces ve Thermobacillus cinsleridir. Tanımlanan termofilik türlerden çoğu, 16S rRNA analizlerine göre oluşturulan Bacillus genetik gruplarından, grup 1 ve grup 5’e dahil edilmişlerdir. Bacillus smithii ve Bacillus coagulans; bu genusun tip türü Bacillus subtilis ve diğer mezofilik türlerle birlikte, grup 1’ de yer almaktadır (Nazina et al., 2001). Grup 5, 16S rRNA dizileri arasında oldukça fazla benzerlik bulunan (% 98.5-99.2) termofilik basillerin, fenotipik ve filogenetik olarak oldukça uyumlu bir grubudur. Bu grup, tanımlanmış olan termofilik Bacillus türlerini (Bacillus stearothermophilus, Bacillus thermocatenulatus, Bacillus thermoglucosidasius ve Bacillus thermodenitrificans); henüz geçerli olarak tanımlanmamış bazı türleri (Bacillus caldolyticus, Bacillus caldotenax, Bacillus caldovelox ve Bacillus thermoantatarcticus) ve asporogenez bir tür olan Saccharococcus thermophilus’u içermektedir. Filogenetik analizler sonucu, Bacillus genusu ve termofilik üyeleri için, oldukça kapsamlı taksonomik bir revizyona ihtiyaç olduğu düşünülmektedir (Nazina et al., 2001). Bacillus genusunda bulunan bakterilerin kendi aralarındaki tür farklılıklarına bakıldığında, (Balows et al., 1991), izolatların katalaz pozitif, VP negatif olmaları ve 65 C de gelişmelerinden dolayı B.stearothermophilus türüyle aynı özellikleri taşıyabilecekleri düşünülmüştür (Çizelge 5). Çizelge 5. Bacillus türlerinin tayin anahtarı
negatif...........17
negatif..........10
negatif..........9
negatif................................6
negatif..............................B. coagulans
negatif.............7 7. Nitratı nitrite indirgeme: pozitif................................................8 negatif............................................B. alvei
negatif.................B. cereus
negatif...............................................................15 10. 65C‘de gelişim:pozitif..............................B.stearothermophilus negatif..................................................... 11
negatif........................................................15
negatif...........13
negatif.................14
negatif...........................................B. firmus
negatif............................................16
negatif........................B. sphaericus
negatif..........................................................18
negatif.................................................19
negatif...................B. lentimorbus Nazina et al., (2001) tarafından yapılan araştırmada, Bacillus stearothermophilus, yeni tanımlanan bir genus olan Geobacillus cinsi içerisinde Geobacillus stearothermophilus olarak tanımlanmıştır. Araştırmada, Rusya, Kazakistan, ve Çin’deki petrol alanlarında oluşan sulardan, hidrokarbon oksitleyen, termofilik, nötrofilik, hareketli, spor oluşturan, aerobik veya fakültatif anaerobik 5 suş elde edilmiştir. 16S rDNA analizi ve DNA-DNA hibridizasyon verileri temel alınarak, bu yeraltı izolatları, 2 grup içinde ele alınmıştır. Bu gruplardan biri UT ve X soylarından, diğeri ise, K, Sam ve 34T soylarından oluşmaktadır. Yeni soylarda, (termofilik Bacillus gruplarından) grup 5 ile yakın bir filogenetik ilişki saptanmıştır. 16S rRNA ve yağ asidi kompozisyon analizlerine göre, bu yeraltı izolatları, yeni bir cins içerisindeki, 2 farklı yeni tür olarak belirlenmiştir (Geobacillus uzenensis, Geobacillus subteraneus). Aynı zamanda, önceden Bacillus thermoleovorans, Bacillus thermocatenulatus, Bacillus kaustophilus, Bacillus thermoglucosidasius ve Bacillus thermodenitrificans olarak bilinen türlerin de bu yeni cinse transfer edilmesini önermişlerdir. Geobacillus cinsinin tanımlanması ise Nazina et al., (2001)’ e göre şu şekildedir: vejetatif hücreler çubuk şeklindedir ve hücre başına tek bir endospor üretilir. Hücreler, tekli veya kısa zincirler halinde bulunmaktadırlar ve peritrik flagella ile hareketli ya da hareketsizdirler. Hücre duvarı yapısı, gram pozitiftir, fakat Gram boyanma reaksiyonu, pozitif ve negatif arasında değişebilmektedir. Elipsoidal veya silindirik endosporlar terminal veya subterminal konumlu olup, hafifçe şişkin veya şişkin olmayan sporangia içinde yer almaktadır. Koloni morfolojisi ve boyutu, değişkendir, bazı ortamlarda pigment üretimi olabilmektedir. Kemoorganotrofturlar. Aerobik veya fakültatif anaerobiktirler. Oksijen son elektron alıcısıdır, bazı türlerde nitrat oksijenin yerini alabilmektedir. Zorunlu termofiliktirler. Gelişim için gerekli sıcaklık aralığı, 37-75 C ; optimum sıcaklık ise 55-65 C dir. Nötrofiliktirler. Gelişim için gerekli pH aralığı 6.0-8.5; optimum pH ise 6.2-7.5 arasında değişmektedir. Birçok tür gelişim için, vitaminlere, NaCl, KCl ve gelişme faktörlerine ihtiyaç duymamaktadır. Glikoz, fruktoz, maltoz, mannoz ve sukrozdan asit oluşumu vardır, ancak gaz oluşumu yoktur. Birçok tür laktozdan asit oluşturmamaktadır. Birçok tür katalaz pozitiftir. Fenilalanin deaminasyonu yoktur, tirozin degrade edilmemektedir. İndol oluşumu yoktur, Voges-Proskauer reaksiyonu negatiftir. Oksidaz pozitif veya negatif olabilir. Hücresel major yağ asitleri iso-15:0, iso 16:0 ve iso 17:0 olup, toplamın % 60’ını oluşturmaktadır. Başlıca menaquinone tipi, MK-7’dir. DNA’nın G+C içeriği, % 48.2-58 moldur. Bu genusun üyeleri için, 16S rRNA gen dizisi benzerlik oranları % 96.5’ den daha fazladır. Birçok tür doğada yaygın olarak bulunmaktadır. Tip tür Geobacillus stearothermophilus (bazonimi Bacillus stearothermophilus Donk 1920) ; bu türün tip suşu ise strain DSM 22T’ dir. Geobacillus genusu ile Bacillus genusu arasındaki farklar Çizelge 6’da özetlenmiştir. Çizelge 6. Geobacillus genusu ile Bacillus genusu arasındaki farklar ( Nazina et al., 2001)
Bu verilerden yola çıkılarak, izolatların kültürel, morfolojik, biyokimyasal ve fizyolojik özellikleri ile Geobacillus stearothermophilus olarak tanımlanan türün özellikleri karşılaştırılmıştır. Yapılan karşılaştırmalarda, bu türün bazonimi olan Bacillus stearothermophilus’un özelliklerinden yararlanılmıştır (Sneath et al., 1986) . İzolatlardan yapılan gram boyamalarda D3, D4 ve 1 numaralı izolatın 24 saatlik kültürlerinde gram değişken, daha genç kültürlerinde ise gram pozitif boyandıkları görülmüştür. 3 numaralı izolat ise gram negatiftir. Daha önce bahsedildiği gibi, Geobacillus cinsi içerisinde gram boyanma açısından farklılıklara rastalanabildiği; örneğin, Geobacillus uzenensis strain X olarak tanımlanan soyun gram negatif boyandığı bildirilmiştir (Nazina et al., 2001) 3 numaralı izolat, gram negatif boyandığı ve yapılan boyamalarda endospora rastlanmadığı için, ilk başlarda Thermus genusuna ait bir tür olarak düşünülmüştür. Ancak hareketlilik ile ilgili yapılan deneyler sonucu, bu izolatın hareketli olduğu bulunmuştur. Oysa Thermus genusu, hareketsiz türlerden oluşmaktadır . Bunun üzerine endospor oluşumunu indükleyici şartlar altında bu izolatın spor oluşturup oluşturmadığı kontrol edilmiştir. Yapılan bir araştırmada sıcak su tanklarından izole edilen bir Thermus suşunun, nişasta agarda bile endospor oluşturmadığı bildirilmiştir (Holt, 1993). Nişasta agar, endospor oluşumunu teşvik ettiği için, 3 numaralı izolat nişasta agarda geliştirilmiştir. Bacillus suşları, tüm kültürel şartlar altında endospor oluşturmamaktadır. Bu özellik, spor oluşturmayan Bacillus suşlarının, diğer cinslerle karıştırılmasına neden olabilmektedir. Birçok Bacillus suşu, % 1-5 mg oranında mangan tuzlarının bulunduğu nutrient agar ortamında sporlanmaktadır, fakat bu özelliklerini kaybetmiş ya da yalnızca tekrarlanan transferler sonucunda spor oluşturma yeteneğinde olabilecekleri bildirilmiştir. Bu tür kültürler, oligosporogenoz (Osp) olarak adlandırılmıştır. Ayrıca spor oluşumunu etkileyen daha pek çok faktör bulunmaktadır. Örneğin; gelişim sıcaklığı, ortamın pH sı, havalandırma, mineral varlığı, bazı karbon ve azot bileşikleri ve karbon ve azot kaynakları bu özelliği etkilemektedir (Sneath et al, 1986). 3 numaralı izolat MnSO4 ‘ lü ortamda geliştirilmiş ve bu kültürden endospor boyama yapılmıştır. Sonuçta, terminal konumlu endosporlara rastlanmıştır. Endosporların şekli açısından bakıldığında izolatların da Geobacillus stearothermophilus gibi, elipsoidal şekilli endosporlar oluşturdukları görülmüştür. Ayrıca izolatların da spor oluşturan ana hücreleri, yani sporangiumları şişkin haldedir. Bacillus genusu içerisinde, sporların, sentral, parasentral, subterminal, terminal veya, lateral konumlu olabileceği ve bazı durumlarda hücre dışına çıkmış halde bulunabilecekleri bildirilmiştir (Sneath,1986). İzolatların endosporları ise terminal-subterminal konumludur. Bu özellik, aynı zamanda Geobacillus cinsi için tanımlanmış bir özelliktir. 3 numaralı izolatta sentral endosporlar da görülmüştür. Özellikle 24 saatten sonraki geç kültürlerde sporlar oldukça fazla miktarlarda dağılmış görünmektedirler. Fizyolojik özelliklerin belirlenmesi, bakterilerin sınıflandırılmasında ve de optimum gelişme şartlarının saptanmasında önemlidir. İzolatların farklı sıcaklık değerlerinde gelişip gelişmedikleri araştırılmış ve bu özellikler açısından Geobacillus stearothermophilus ile karşılaştırılmışlardır. G. stearothermophilus un geliştiği sıcaklık aralığı 37-65 C olarak verilmiştir. Tüm izolatlar için, optimum üreme sıcaklığı, 65 C; maksimum sıcaklık ise 72-73 C olarak bulunmuştur. Bu durum, izolatların yaşadığı çevrenin sıcaklığı ile ilgili olabilir. 3 numaralı izolat dışında hepsi, 40 C de zayıf da olsa gelişme göstermişlerdir. Sıcaklık istekleri açısından bakıldığında, izolatların zorunlu termofil olduklarını söylemek mümkündür . İzolatlar optimum pH 6’da gelişmişlerdir. pH 5’ de ise gelişim gözlenmemiştir. Bu özellikleri ile termofilik ve asidofilik bir Bacillus türü olan Bacillus acidocaldarius’tan ayrılmaktadırlar. Ayrıca Bacillus acidocaldarius, 5.7 pH’ya sahip nutrient broth’da gelişmekte, fakat bu ortamda 6.8 pH’da gelişmemektedir. Oysa bu durum izolatlar ve Bacillus stearothermophilus için tam tersidir. Tolere edebildikleri tuz konsantrasyonları açısından, izolatlar araştırıldığında, % 2, % 5, % 7 ve %10 oranında NaCl içeren ortamlarda gelişmedikleri görülmüştür. 3 numaralı izolat % 1 lik tuz ortamında da gelişmemiştir. Optimum tuz konsantrasyonu ise % 0.5-1 olarak belirlenmiştir. Geobacillus stearothermophilus’un ise birçok soyu % 5 oranında tuz bulunan ortamlarda gelişebilmektedir. Ancak bu konsantrasyonu tolere edemeyen ve optimum % 0.5-1 arasındaki NaCl konsantrasyonlarında gelişen Geobacillus türleri de tanılanmıştır (Nazina et al., 2001). Dülger, S. 1997’de yaptığı araştırmada, Ayder kaplıcasından fakültatif termofilik Bacillus türlerini izole etmiştir. İzole edilen suşların gram değişken özellik taşıdığını belirtmiştir. İzolatların tanısını yapabilmek amacıyla, morfolojik, biyokimyasal , fizyolojik özelliklerini incelemiş ve bulguları desteklemek amacıyla total protein profillerini ve 16S rRNA genlerinin RFLP’sini çıkarmıştır. İzolatların bazı özellikleri açısından ve aynı sıcaklık aralıklarında yaşamalarından dolayı B. flavothermus’a benzer olduklarını, ancak hem total protein profilleri, hem de 16S rRNA genlerinin RFLP’leri bakımından B. flavothermus’tan farklı türler olduklarını bildirmiştir. Bu çalışmada izole edilen türler ise birçok özellikleri bakımından B. flavothermus’tan farklıdırlar. En büyük farklılık ise, B. flavothermus’ un fakültatif termofil, izolatların ise zorunlu termofil olmasıdır. Bacillus stearothermophilus için en ayırdedici özellik, 65 C de gelişme özelliği ve aside karşı sınırlı bir tolerans göstermesidir (Sneath,1986).Ayrıca izolatlar gelişebildikleri NaCl konsantrasyonları, pH aralıkları açısından da B. flavothermus’dan ziyade Bacillus stearothermophilus’ a daha yakındırlar. Yapılan biyokimyasal testler sonucunda ise, bazı özellikler açısından izolatların kendi aralarında farklı oldukları bulunmuştur. 4 numaralı izolat, nişasta hidrolizinin olmayışı, özelliği ile hem Bacillus stearothermophilus’dan, hem de diğer izolatlardan farklılık göstermektedir. Ayrıca diğer izolatlardan farklı olarak, 4 numaralı izolat nitrattan gaz oluşturmamaktadır. 3 numaralı izolat ise üreyi hidroliz etmektedir. Diğer izolatlar ve Bacillus stearothermophilus bu özellik açısından negatiftir. Karbohidratların fermentasyonu açısından bakıldığında 4 numaralı izolat , glikoz dışında hiçbir karbohidratı (mannitol, arabinoz, ksiloz) fermente etmemiştir. D3, D4,1 ve 3 numaralı izolatların ise tümü, arabinoz negatif, ksiloz pozitiftir. D4 ve 3 numaralı izolat mannitolu fermente ederken, diğerleri edememiştir. B. stearothermophilus türünde ise, glikoz dışındaki şekerler için (arabinoz, mannitol ve ksiloz), bazı soyların pozitif (% 11- 89), bazılarının ise negatif olabileceği bildirilmiştir (Sneath et al, 1986). Biyokimyasal testlere göre izolatlardan D3, D4 ve 1 numaralı izolatlar, en çok bu türe yakın bulunmuştur. Bacillus stearothermophilus türü içerisinde çok fazla heterojenite olduğu bildirilmiştir. Bu türe ait olan suşlar hem fenotipik özellikleri açısından hem de DNA baz kompozisyonları ile oldukça geniş bir çeşitlilik göstermektedirler (Sneath et al,1986). Bu özellikler dışında izolatların tümünün, test edilen biyokimyasal aktiviteler ve fizyolojik özellikler açısından birbirleriyle aynı özellikleri taşıdıkları bulunmuştur. Tüm bu sonuçlardan yola çıkılarak, D3, D4 ve 1 numaralı izolatlar, Bergey’in Sistematik Bakteriyoloji kriterlerine göre Bacillus stearothermophilus olarak belirlenmiştir. Yalnızca D3 izolatının diğerlerine göre bakıldığında,Bacillus stearothermophilus’ un farklı bir suşu olabileceği düşünülmektedir. 4 numaralı izolat, nişasta hidrolizinin olmayışı, ve hareketsiz olması nedeniyle Bacillus stearothermophilus’tan farklıdır. Ayrıca, gram reaksiyonu ve ksilozdan asit oluşturmaması nedeniyle diğer izolatlardan da farklılık göstermektedir. Termofilik Bacillus türlerinden Bacillus kaustophilus’ un da hareketsiz bir tür olduğu bildirilmiştir (White et al., 1993 ). Ancak, 4 numaralı izolatla karşılaştırıldığında, bu tür, hücre genişliği (1.5 m), glikoz fermentasyonu (-), maksimum ve minimum gelişme sıcaklıkları gibi özellikleri açısından farklıdır. Diğer termofilik Bacillus türleriyle yapılan karşılaştırmalarda da daha fazla bir yakınlık derecesi saptanamadığından 4 numaralı izolatın diğerlerinden farklı bir tür olabileceği düşünülmüş ve Bacillus sp. 4 olarak tanımlanmıştır. 3 numaralı izolat ise, 40 C’de ve % 1’lik NaCl ortamında gelişmemesi, ayrıca üreaz enzimine sahip olması nedeniyle, diğer izolatlardan ve Bacillus stearothermophilus’tan farklı görünmektedir. Bu izolatın gram reaksiyonu (-), koloni ve hücre morfolojisi de, diğerlerinden oldukça farklıdır. Kolonileri şeffaftır, ve hücreler oldukça uzun zincirler oluşturmaktadır. Ayrıca belli şartlar altında endospor oluşturmaktadır. Bu sonuçlara göre, hem diğer izolatlardan, hem de Bacillus stearothermophilus’tan farklıdır. Diğer termofilik Bacillus türleri ile de daha yakın bir benzerlik bulunamadığı için, diğerlerinden farklı bir tür olduğu düşünülerek, bu izolat, Bacillus sp.3 olarak tanılanmıştır. 4. SONUÇLAR VE ÖNERİLER Bu çalışmada, Aydın ilinde bulunan Bozköy-Alangüllü kaplıcalarındaki kaynak sularından termofilik bakteriler izole edilmiştir. İzolatların kültürel, morfolojik, fizyolojik ve biyokimyasal özellikleri araştırılmış ve sonuçta, üç tanesinin tür düzeyinde tanısı yapılmıştır. Buna göre D3, D4 ve 1 numaralı izolatlar, Bacillus stearothermophilus olarak tanılanmıştır. Diğer ikisi ise, çeşitli özellikleri açısından hem diğerlerinden, hem de birbirlerinden farklı oldukları için Bacillus sp.3 ve Bacillus sp.4 olarak tanımlanmışlardır. Bu izolatların stok kültürleri, Adnan Menderes Üniversitesi, Fen Edebiyat Fakültesi, Biyoloji Bölümü Moleküler Biyoloji Anabilim Dalı’nda muhafaza edilmektedir. Türkiye’de, daha önce sıcak su kaynaklarından Bacillus stearothermophilus izolasyonuna dair literatür bilgisine rastlanmamıştır. Dolayısıyla, izolatların Türkiye’deki bakteri florası için yeni kayıtlar olduğu düşünülmektedir. Günümüzde, bakteriyal teşhis açısından, moleküler tekniklerle yapılan çalışmalar oldukça cazip görünmektedir. Ancak, bu tür çalışmaların, geleneksel metotlar sonucunda elde edilen bulgularla desteklenmesi gerekmektedir. Fenotipik özellikleri temel alan çalışmalar hala geçerliliğini korumaktadır. Fakat yine de, izolatların kesin tür tanısını yapabilmek için, ileride moleküler düzeyde çeşitli araştırmalar yapılması düşünülmektedir. İzole edilen bakteriler sıcaklık istekleri açısından termofiliktirler. Termofilik mikroorganizmaların enzimleri yüksek sıcaklıklarda iş görmekte ve bu özellikleri ile pek çok açıdan avantajlı olmaktadırlar. Bu tür mikroorganizmalar, endüstride ve biyoteknolojide, ayrıca atık su arıtımında oldukça büyük öneme sahiptir. Bu izolatlardan, elde edilecek enzimler, daha farklı araştırmalarda ve pek çok enzim çalışmalarında kullanılabilir. Yüklə 354,88 Kb. Dostları ilə paylaş:
|