Moleküler dünyadaki hızlı gelişmeler, enzim biyoteknolojisi ve sanayi alanlarındaki üretim çeşitliliği, bilim insanını yeni araştırmalara sürüklemektedir

Beslenmeyle ilgili özellikleri, total protein profilleri, DNA-DNA hibridizasyonları, ve 16S rRNA (16S rDNA)’ larının RFLP profilleri göstermiştir ki, sıcak kompostlardan izole edilen Thermus suşları, Thermus thermophilus HB8 ile oldukça yakın ilişkilidir. Yeni izole edilen bu Thermus suşları, muhtemelen sıcak kompost ekosistemlerindeki koşullara adapte olmuştur. Heterotrofik, oval-spor oluşturan termofilik basiller de sıcak kompostlardan izole edilmiştir, fakat bu izolatlardan hiçbiri, 70 C’nin üzerindeki sıcaklıklarda gelişme yeteneğinde değildir. Bu çalışmaya göre Thermus suşları, kompostlaşma işleminin termojenik fazı boyunca (65-80C), organik madde degredasyonunda önemli rol oynamaktadır ( Beffa et al., 1996 )

Yapılan diğer bir araştırmada ise kompostlardan izole edilen termofilik heterotrofik, bakteriyal suşların, 16S ribozomal DNA’ları PCR ile çoğaltılmıştır ve bunların restriksiyon enzim profilleri referans suşlar ile karşılaştırılmıştır. Bu çalışma sonucunda, dört farklı Bacillus türü saptanmıştır ki bunlar B. stearothermophilus, B. pallidus, B. thermoglucosidasius, B. thermodenitrificans’ dır (Blanc et al., 1997).

Llarch et al.(1997), yaptıkları bir araştırmada Güney Shetland yarımadasındaki jeotermal alanlardan alınan su ve sediment örneklerinden 10 bakteri suşu izole etmişlerdir. Bu suşlar termofilik, gram pozitif, aerobik, katalaz pozitif, endospor oluşturan 6 farklı çeşittir ve Bacillus sp. olarak tanımlanmıştır. 6 temsili suş, rutin fenotipik karakterizasyon, numerik taksonomi ve kemotaksonomik analizler açısından incelenmiştir. Bu incelemeler sonucunda iki izolat B.licheniformis ve B.megaterium’un termofilik suşları olarak tanımlanmıştır. Fakat diğer 4 soy, bilinen Bacillus türleri içinde sınıflandırılamamıştır ve bunlar yeni suşlar olarak düşünülmüştür.

Hayashi et al., (1994), Tayland’ın kuzeyindeki sıcak su kaynaklarından üç siyanobakteri suşu izole etmişlerdir. Morfolojik ve fizyolojik çalışmalara göre üç suşunda Chroococcidiopsis genusuna ait olduklarına karar verilmiştir. Gelişim için gerekli optimum sıcaklık 50 C civarında ve optimum pH 8.0 dir.

Thermus aquaticus YT1’in Brock tarafından 1969 yılında ilk kez izole edilmesinden bu yana , termofilik mikroorganizmalarla ilgili birçok araştırma yapılmıştır. Araştırmalar sonucu, bunların termostabilitelerini sağlayan faktörlerin makromolekülleri ve membranları ile ilgili olduğu görülmüştür (Shen, 1970; Daron 1970).

Genelde yaşamsal işlevleri engelleyen sıcaklıklarda, obligat organizmaların sıklıkla bulunması şaşırtıcı görünmektedir. Canlı hücreler temelde, su içeren kimyasal sistemler oldukları için var olmaları, teorik olarak suyun likid durumda (sıvı fazda) bulunduğu sıcaklık ile sınırlıdır. Bununla birlikte, yaşamla uygunluk gösteren kesin sıcaklık limitlerini saptamak zordur. Birçok protein ve nükleik asit, ayrıca düşük molekül ağırlıklı bileşiklerin çoğu, bu doğanın sıcaklıklarında denatüre olduğu için, bu tür şartlarda varolan herhangi bir mikroorganizma hayatını sürdürebilmek için alışılmadık mekanizmalara sahip olmalıdır. Yüksek sıcaklıklarda termofilik mikroorganizmaların hayatta kalması ile ilgili birçok genel mekanizma önerilmiştir. Önerilen bu mekanizmalar genelde üç kavram etrafında yoğunlaşmıştır. Birincisi; dayanıklılık lipid etkileşimleri ile sağlanıyor olabilir, ikincisi; ısıyla bozulan hücresel bileşenler hızlıca ve yeniden sentezleniyor olabilir, üçüncüsü ise termofilik mikroorganizmalarda kalıtsal olarak ısıya dayanıklı makromoleküller bulunmasıdır. Kabul gören teoriler lipidler ve makromoleküler komplekslerle ilgili olanlardır. Çünkü termofili olgusunda en önemli faktör, bu organizmaların biopolimerlerinin yüksek iç (intrinsik) termostabilitesidir (Langworthy T. A., 1979).

Araştırmalara göre termofil ve mezofillerin hücre duvarları ve membranlarında farklılıklar oluşmaktadır. Psikrofiller, doymamış yağ asidi bakımından zengin membran lipidlerine sahiptirler. Bu sayede membranları düşük sıcaklıklarda akışkan ve fonksiyoneldir. Bunun tersine termofiller, doymuş yağ asidi bakımından zengin membran lipidlerine sahiptirler. Böylece membranları yüksek sıcaklıklarda stabil ve fonksiyonel kalır. Doymuş yağ asitleri, doymamış yağ asitlerinden çok daha kuvvetli hidrofobik bağlar içerir ki bu bağlar membran stabilitesi açısından avantajdır. Hipertermofilik bir bakteri olan Thermotoga maritima’nın, membran lipidlerinde yeni bir gliserol eter lipidine rastlandığı bildirilmiştir. Mezofillerdeki ester lipidlerinin tersine, bu maddenin yüksek sıcaklıklarda hidrolize karşı, membran stabilitesini koruyor olabileceği düşünülmüştür. Bunun tersine tüm Arkea’daki membranlar (mezofiller de dahil), difitanil-gliserol veya di (bifitanil)-digliseroldan köken alan eter lipidlerine sahiptir ve bu sayede asidik pH’ya ve yüksek sıcaklıklarda parçalanmaya karşı dirençlidir. Hipertermofillerdeki DNA çift sarmalının dayanıklılığı ise, reverse gyrase enzimi sayesinde olmaktadır. Tip 1 DNA polimeraz, pozitif supertwist (süper ikili) yapıyı oluşturarak, kararlılığı sağlar. Ek olarak, arkeal hipertermofiller, ökaryotlarda bulunanlara benzer histonlar içermektedirler. Saflaştırılmış DNA’ya in vitro ortamda histon eklenmesinin, erime noktasını oldukça artırdığı bilinmektedir (Stetter, 1999).
Makromoleküler teori, termofillerdeki ve mezofillerdeki nükleik asit ve protein yapılarının karşılaştırılması sonucu görülen fiziksel ve kimyasal farklılık ile ilgilidir. Bu hipotezin desteklenmesinde, termofillerden saflaştırılan birçok enzimin, hem ısıya, hem de denatüre edici ajanlara karşı dayanıklı olduğu bir gerçektir. Bu yüzden, bu enzimler, aktivitelerinde ihmal edilebilir bir kayıp ile in vitro olarak çalışabilirler. Hücredeki enzimler ve diğer proteinlere ek olarak, termofillerin ve hipertermofillerin protein sentezleyen sistemleri (ribozomlar ve diğer bileşenler) de ısıya dayanıklıdır (Singleton and Amelunxen, 1973).
Termofilik enzimlerle yapılan çalışmalar göstermiştir ki, bunlar, mezofillerde aynı reaksiyonu katalizleyen enzimlerden, aminoasit dizisi bakımından az da olsa farklıdırlar. Enzimdeki bir veya birkaç lokasyonda, aminoasit dizilimi bakımından farklılık vardır ve bu şekilde ısının denatüre edici etkilerinden korunmuş olurlar.

Nükleik asitler açısından bakıldığında ribozomal ve transfer RNA ile yapılan kimyasal çalışmalarda, bu makromoleküllerde termal dayanıklılığı sağlayan modifiye bazların olduğu bulunmuştur (Watanabe and Oshima, 1974).

Uzun yıllar boyunca, mikrobiyologlar termofilik bakterileri 55 C’de inkübe ederek zenginleştirmişlerdir. Fakat termofilik bakterilerin tümü optimum 55 C’de gelişmezler. Bu mikroorganizmalar, mezofilik aralığa yakın bir optimumdan, 70 C ve üzerine kadar uzanan bir sıcaklık optimumuna sahiptirler. 55 C de ekstrem termofiller yavaş gelişirler ve muhtemelen bu yüzden B. stearothermophilus gibi spor oluşturan termofiller ile yarışamamaktadırlar. 70-75 C de, ekstrem termofiller seçici bir avantaja sahiptirler ve kolayca izole edilebilirler. Ekstrem termofillerin zenginleştirilmesinde kullanılan ortamlar organik bileşik açısından oldukça seyreltik olmalıdır. Önceki çalışmalarda, ekstrem termofillerin görülmemesinin sebebi, izolasyonda kullanılan birçok ortamda yüksek oranda organik bileşik bulunması olabilir (Brock and Freeze, 1969).

Termofillerin kültürleri yapılırken, geleneksel metotların modifiye edilmesi gerektiğinden birçok sorunla karşılaşılmaktadır. Kaldoaktif ve barotermofillerin kültivasyonunda yeni metot ve ekipmanların geliştirilmesi gerekmektedir. Çünkü yüksek inkübasyon sıcaklıklarında, hem katı hem de sıvı ortamlarda daha fazla buharlaşma olmaktadır.

65-70 C’nin üzerindeki sıcaklıklarda birçok plastik agar kabı erir, agar dayanıksız hale gelir. Ortam bileşenleri daha thermolabil (sıcaklığa dayanıksız) olur, örneğin; artan sıcaklıklarda, şekerlerin karamelizasyonu daha hızlı olmaktadır. 55 C’nin üzerindeki sıcaklıklarda, buharlaşmayı azaltmak için % 2-4 agar kullanılması gerekmektedir. 70 C’nin üzerindeki sıcaklıklarda silika jel gibi katı ortamların kullanılması gerekmektedir. Son zamanlarda Pseudomonas sp.den elde edilen ve ticari olarak Gelrite adıyla satılan bir zamk, Mg⁺² ya da Ca⁺² gibi divalent katyonlarla katılaştırılan bir maddedir ve yüksek sıcaklıklarda katı ortam olarak kullanışlıdır. Bu madde, deniz altındaki hidrotermal deliklerden oldukça termofilik mikroorganizmaların kültüründe kullanılmıştır ve 120 C de katılığını korumaktadır. Marteinsson et al., (1997) deniz dibindeki hidrotermal kuyularda gelrite içeren katı ortamlar kullanarak in situ örnekleme yapmışlardır. Gelrite bloklarının yüzeyinde karışık mikroorganizma populasyonu zenginleştirilmiştir. Termofilik Bacillus sp. ve Thermotogales ordosuna ait olan bakterileri izole etmiştir.

Kaldoaktif ve barotermofil türlerin kültivasyonu için, özelleştirilmiş bir aparata ihtiyaç vardır. Örneğin 70 C civarındakileri, su banyolarında yetiştirmek mümkündür. Bununla birlikte yüksek sıcaklıklarda buharlaşma birçok problem çıkarmaktadır, bu durum sudan daha yüksek kaynama noktasına sahip sıvıların, örneğin gliserolün kullanılmasıyla giderilebilir.

Huber et al. (2000), karışık kültürlerden, hipertermofillerin hızlı ve güvenilir bir şekilde izolasyonunu sağlayan, plaklardan bağımsız yeni bir metot geliştirmişlerdir. Bu metot, lazer mikroskop kullanılarak, zenginleştirme kültürlerinden tek bir hücrenin ayrılmasını ve sonrasında geliştirilmesini temel almaktadır. Bu teknik sayesinde, bulundukları çevreleri işgal eden hipertermofillerin, tüm ordo ve familya temsilcilerinin başarılı bir şekilde izole edildikleri bildirilmiştir

Termofilik ve hipertermofilik mikroorganizmalar, temel biyolojik sebeblerin dışında da araştırma konusudur. Bu organizmalar, endüstriyel ve biyoteknolojik avantajları bakımından da incelenmektedirler ki, bunların birçoğu, yüksek sıcaklıklarda daha hızlı ve etkili iş görürler. Termofil ve hipertermofillerin enzimleri, yüksek sıcaklıklarda biyokimyasal reaksiyonları katalizleme yeteneğine sahiptirler ve genelde mezofillerin enzimlerinden daha kararlıdırlar. Isıya dayanıklı bu tür enzimler arasında, uygulama açısından en önemlisi, Thermus aquaticus dan elde edilen Taq polimerazdır ve PCR teknolojisinde kullanılır. Ayrıca Pyrococcus furiosus’tan elde edilen Pfu ve de Thermotoga maritima’dan elde edilen UITma’da bu amaçla kullanılan enzimler arasındadır (Huber and Stetter, 1998).

Altıntaş et al. (1998), yaptıkları araştırmada, Thermus aquaticus’tan HPLC ( yüksek performanslı sıvı kromatografisi ) yöntemi ile Taq 1 polimeraz enziminin saflaştırılması üzerine prosedür geliştirmişlerdir. HPLC yöntemi ile bu enzimin saflaştırılması üzerine etkili faktörleri belirlemişlerdir.

Termofilik mikroorganizmaların bazı enzimleri ise, endüstride oldukça fazla kullanım alanına sahiptir. Bu tür araştırmalar, daha çok Bacillus ve Thermus türleri üzerinde yoğunlaşmıştır. Endüstride en çok kullanılan termofilik enzimleri, proteazlar, sellülazlar, amilazlar, ksilonazlar, pullulonazlar gibi ekstraselüler enzimlerdir. İntraselüler enzimlere ise, dehidrojenazlar, oksidoredüktazlar ve yukarda bahsedilen DNA polimerazlar örnek olarak verilebilir. Özellikle, hipertermofillerden elde edilen enzimlerden bazıları, 100 C’de, saatler sonra bile, aktivitesini çok fazla kaybetmemektedir. Hatta, izole edildikleri yerin maksimum sıcaklığını aşan sıcaklık derecelerinde, aktif olmaktadırlar ( Huber and Stetter, 1998).

Cramp et al., (1997) yaptıkları araştırmada, literatürde ilk kez nitril degrade edici enzimleri üreten termofilik bir bakteri izole ettiklerini bildirmişlerdir. İzole edilen soylardan bir tanesi, detaylı olarak çalışılmıştır. Bacillus pallidus olarak sınıflandırılan Dac521 suşu, minimal besin ortamında tek karbon ve azot kaynağı olarak asetonitril, benzonitril, propionitril, asetamid, benzamid ve propionomidi kullanarak gelişme yeteneğindedirler. Tüm hücre preparasyonlarında ve hücresiz özütlerdeki hem asetonitril, hemde benzonitril degrade edici enzim sistemleri mezofilik temsilcileri ile karşılaştırıldığında daha stabildir.

Hipertermofilik Aquifex aeolicus’tan elde edilen termostabil ve çözücülere dayanıklı olan aminopeptidaz enziminin geni klonlanmış ve E. coli’de ifade edilmesi (ekspresyonu) sağlanmıştır. Gen ürünü saflaştırıldığında ve karakterizasyonu yapıldığında, metanol, etanol, aseton, asetonitril gibi birçok organik çözücüye karşı dayanıklı olduğu saptanmıştır. B. stearothermophilus ve Sulfolobus solfataricus’un da aminopeptidazlarının, organik çözücülere karşı oldukça dayanıklı olduğu bildirilmiştir (Khan et al. 2000).

Termofillerin enzimleri ile ilgili yapılan araştırmaların sonuçları, filogenetik olarak da önem taşımaktadır. Örneğin, Sulfolobus solfataricus’un demir ( ıron ) süperoksit dismutaz enzimi izole edilmiş ve yapılan analizlerin sonuçları, diğer Arkea veya termofilik öbakteriler ile karşılaştırılmıştır ( Russo et al, 1997 ).

Yugoslavya’daki kaplıca sularından izole edilen, B. stearothermophilus ve Thermothrix sp. olarak tanımlanan iki termofilik bakteriden, hücresiz özütlerde, yüksek oranda SOD (superoksit dismutaz) aktivitesi olduğu bildirilmiştir ve araştırma sonucu, bu iki bakteriyal soyun, antioksidant savunma sistemleri açısından, endüstriyel skalada oldukça önemli olduğu vurgulanmıştır (Gligic et al. 2000).

Enzimleri ile ilgili olarak en çok çalışılan Thermus thermophilus’ tan elde edilen -galaktozidazın avantajlarından bahsedilmiştir Buna göre, bu enzim, termostabil olması ve pH optimumu (pH 6.6) açısından, uzun süre mikrobiyal kontaminasyon olmaksızın, immobilize bir sistem ile süt endüstrisinde kullanılabilmekte ve yarar sağlamaktadır (Maciunska et al. 1998).

Yapılan diğer bir araştırmada ise, Thermus suşlarından ilk defa -amilaz izole edildiği bildirilmiştir (Shaw et al., 1995). Bu enzim de diğer termofil enzimleri gibi sıcaklığa dayanıklıdır ve stabilitesi açısından geniş bir pH aralığına sahiptir. Bu sebeplerden dolayı, enzimin sıvı deterjanlara katılarak sert ve ılık sularda kullanılabileceği ayrıca gıda endüstrisi açısından da pek çok yarar sağlamaktadır.

Termofilik mikroorganizmalar, arıtım işlemlerinde de kullanılmaktadır. Bu teknolojinin avantajları, hızlı biodegradasyon oranları, düşük slaj ürünü ve işlem stabilitesinin oldukça yüksek olmasıdır. Teknik literatürde bildirilen substrat kullanma oranları, analog mezofilik işlemlerde gözlenenlere göre 3-10 kez daha fazladır. Ayrıca slaj üretim oranları genelde anaerobik arıtım işlemlerindeki ile benzerdir. Bu yüzden, termofilik aerobik arıtım, kağıt ve odun endüstrisinde ve diğer birçok miselli atıkların biodegradasyonunda kullanılmıştır. Biodegradasyon oranlarının artması sonucu, arıtım işlemi için gerekli zaman ve böylece maliyet de azalmaktadır. Termofilik aerobik sistemler, özellikle yüksek iyonik güçlü/ az akışkan atık sular için oldukça uygun görünmektedir. Termofilik atıksu arıtımında birincil amaç, atık sudaki organik bileşik miktarını azaltmak olduğu için, dominant mikroorganizmalar genelde aerobik heterotroflardır. Bu sebepten dolayı, bu tür reaktörlerde yalnızca belli başlı Bacillus, Thermus ve Aktinomiset türleri çoğalmaktadır. Termofilik Bacillus sp., hem sıcak su kaynakları, derin deniz kuyuları gibi termal alanlardan, hem de toprak, kompost, yüzey suları ve bozuk gıdalar gibi termal olmayan yerlerden de izole edilebilen heterojen bir gruptur. Thermus sp.’ nin dağılımı daha dardır. Bu bakteriler daha çok sıcak su kaynakları veya derin denizlerdeki kuyulardan izole edilmekle birlikte, evsel sıcak sularda ve kompostlarda da bulunurlar (Lapara and Alleman , 1999).

Dünya üzerinde birçok sıcak su kaynağı bulunmaktadır, fakat bunlar daha çok özellikle Batı Amerika, Yeni Zelanda, İzlanda, Japonya, Akdeniz Bölgesi, Endonezya, Orta Amerika ve Orta Afrika’ da yoğunlaşmıştır. Dünyadaki sıcak kaynakların tek bir alanda toplandığı en geniş bölge Yellowstone Ulusal Parkıdır (ABD). Bazı kaynaklar sıcaklık açısından farklılık gösterse de diğerleri yıllar boyunca 1- 2 C den fazla değişmemiş ve sabit kalmışlardır.

Türkiye’de de, doğal sıcak su kaynakları oldukça bol bulunmaktadır. Fakat bu kaynaklardan termofilik mikroorganizmaların izolasyonu ve tanısı ile ilgili çalışmalar oldukça az ve yenidir. Kuşcuoğlu (1992), Kızılcahamam (Ankara)’dan izole edilen Thermus soylarının karakterizasyonunu ve genetik analizini çalışmıştır. Dülger (1997)’ de, Trabzon’ daki Ayder kaplıcasından termofilik Bacillus soylarını izole etmiş ve tanılarını yapmıştır. Son (1999), termofilik mikroorganizmaların Türkiye toprak ve sıcak su kaynaklarından izolasyonu ve büyüme şartlarının optimizasyonuyla ilgili araştırmayı yapmıştır . Ayrıca, Türkiye’deki birkaç kaplıcadan, birbiri ile yakından ilişkili, ksilozu kullanabilen, termofilik basil formunda bakteriler izole edildiği ve bunların DNA-DNA hibridizasyon çalışmaları sonucu, diğer özellikleri bakımından oldukça benzediği Anoxybacillus flavithermus’tan farklı olduğu bildirilmiştir. (Beldüz ve ark., 2001).

Aydın ili de jeotermal alanlar açısından oldukça zengindir ve civarında çeşitli termal kaynaklar bulunmaktadır. Bu araştırmada Aydın iline bağlı Germencik ilçesinde bulunan Bozköy-Alangüllü kaplıcaları örnekleme açısından uygun olduğu için seçilmiş ve alınan sıcak su örneklerinden termofilik bakteriler izole edilerek tanıları yapılmıştır. İzolatların, morfolojik, kültürel ve biyokimyasal özellikleri araştırılmış ve bunların optimum büyüme sartları belirlenmiştir. Elde edilen sonuçlar literatürdeki mevcut bilgilerle karşılaştırılmış ve izolatların tanısı bu bulgulara göre yapılmıştır. Termofilik bakterilerin izolasyonu ve tanısı ile ilgili çalışmalar hem mikrobiyal çeşitliliğinin açıklanmasında hem de enzimleri açısından biyoteknolojik ve endüstriyel olarak önem taşımaktadır.

2. MATERYAL VE METOT

2. 
   
   

2. 1 Materyal
2. 1. 1 Termal su numuneleri
Araştırmada kullanılan su örnekleri, Aydın iline bağlı Germencik ilçesinde bulunan Bozköy-Alangüllü kaplıcalarından alınmıştır. Bu bölgede biri doğal diğeri sondaj kuyusu olmak üzere iki kaynak bulunmaktadır. Doğal kaynaktaki suyun sıcaklığı 59 C, pH’sı ise 6.5 olarak ölçülmüştür. Sondaj kuyusundan alınan suyun sıcaklığı ölçüm anında 67 C, pH’sı ise 6.8 dir. Suyun karakteristiği florür, karbondioksit ve hidrojen sülfür içeren sodyum bikarbonat-klorürlü sudur (Çizelge 1).
Kaynaklardan su örneği alınırken steril, koyu renkli 500 ml lik şişeler kullanılmıştır. Biri sondaj kuyusundan, diğeri doğal kaynaktan olmak üzere 2 farklı su örneği alınmıştır. Doğal kaynaktan su örnekleri alınırken, kaynağın çevresindeki birikintileri ve sedimentleri de içermesine dikkat edilmiştir.

Çizelge 1. Alangüllü kaynak suyunun analiz raporu ( T. C. Sağlık ve Sosyal Yardım Bakanlığı, Refik Saydam Hıfzıssıhha Merkezi Başkanlığı, Çevre Sağlığı Müdürlüğü, Ankara, 2001 )

SÜLFÜR	0.009 mg/l
KLORÜR	817.8 mg/l
SÜLFAT	N.D
KALSİYUM	98.0 mg/l
Mg	29.0 mg/l
Na	992 mg/l
K^+	117 mg/l
Fe	0.3 mg/l
HCO3	1945.9 mg/l
Se	0.003 mg/l
NH3	19.9 mg/l
NO2	0.033 mg/l
NO3	3.52 mg/l
As	0.003 mg/l
Cr	0.012 mg/l
Cd	N.D
Hg	N.D
Ni	0.007 mg/l
Pb	N.D
Antimon	N.D
Cn	N.D
Ba	2.1 mg/l
F	1.09 mg/l
Zn	N.D
Mn	N.D
Cu	N.D

2. 1. 2 Besiyerleri
Thermus ortamı

Tripton	3 g
Maya özütü	1 g
Castenholz 10x bazal çözelti	100 ml
Distile su	1000 ml

NaOH ile pH 7.5-7.8’ e ayarlanır, 1000 ml için 11 g agar eklenir. 131 C de 30 dakika steril edilir. Termofilik bakterileri izole etmek amacıyla kullanılmıştır.