Moleküler dünyadaki hızlı gelişmeler, enzim biyoteknolojisi ve sanayi alanlarındaki üretim çeşitliliği, bilim insanını yeni araştırmalara sürüklemektedir

Nessler çözeltisi

50 g KI, 35 ml soğuk suda çözülür ve hafif bir çökelti kalıncaya kadar HgCl₂’nin doymuş çözeltisi ilave edilir. Daha sonra KOH’in %50’lik çözeltisinden 400 ml ilave edilir ve hacim 1000 ml’ye tamamlanır. Çökmesi için beklenir ve üstte kalan sıvı alınarak kullanılır.

2. 2 Metot
2. 2. 1 İzolasyon ve stok kültürlerin hazırlanması
Su örnekleri laboratuara getirildikten sonra, 10 ml sıvı Thermus ortamı içeren tüplere, sırasıyla 0.5, 1, 2 ve 5 ml’lik ekimler yapılmıştır. Daha sonra ise termofilik bakterilerin zenginleştirilmesi amacıyla 65 ve 70 C lik sıcaklıklarda 24 – 48 saat inkübe edilmişlerdir. İnkübasyondan sonra sıvı besiyerlerinden, % 2-4 oranında agar içeren katı Thermus ortamlarına yayma ekim yapılmış ve daha sonra saf kültür elde etmek amacıyla özeyi her defasında yakarak, çizgi ekimler yapılmıştır. İnkübasyonlarda, fazla buharlaşmayı önlemek amacıyla petrilerin etrafı parafilmle kaplanmıştır.
Saf kültürlerden yatık Thermus ortamlarında stoklar hazırlanmış ve bunlar buzdolabında +4 C de saklanmıştır. Daha sonraki çalışmalar için bu stoklar kullanılmıştır. Aynı zamanda izolatların 24 saatlik sıvı kültürlerinden gliserol stokları ( 0.8 ml kültür/ 0.2 ml steril, % 60’lık gliserol ) hazırlanıp,- 20 C de stok kültürlere alınmıştır.

2. 2. 2 İzolatların morfolojik özelliklerinin belirlenmesi

Gram boyama

İzolatların Gram boyama açısından özelliklerinin belirlenmesi amacıyla, Gram boyama yapılmıştır. Bunun için, yatık Thermus agardaki, genç (24 saatlikten az ) kültürlerden lam üzerinde, distile su ile yayılarak, preparat hazırlanmıştır. Hazırlanan preparatlar, havada kurutularak, ateşte fikse edildikten sonra, Gram’ ın kristal viyole boyası ile 1 dakika boyanmış ve distile su ile yıkanmıştır. Havada kurutulduktan sonra, iyot çözeltisi ile 1 dakika muamele edilmiş ve distile su ile yıkanıp, tekrar havada kurutulmuştur. Daha sonra, aseton alkol (1:1) ile renk giderilmiş ve en son Gram’ ın safranin boyası ile 30 saniye boyanmıştır. Distile su ile yıkandıktan sonra havada kurutulmuş ve preparatlar mikroskopta, 100x’lik immersiyon objektifinde incelenmiştir (Salle, 1967).

Endospor Boyama
İzolatların endospor oluşturup oluşturmadıklarını ve endosporların hücre içerisindeki pozisyonunu belirlemek amacıyla, genellikle yatık Thermus agardaki yaşlı kültürler (48-72 saatlik) kullanılmıştır. Kültürler lam üzerine yayıldıktan ve açık havada kurutulduktan sonra, alevden geçirilerek tespit edilmiştir. Daha sonra, sıcak su buharı üzerine alınan lam üzerine malaşit yeşili ilave edilip, 5 dakika beklenmiştir ve distile su ile yıkanmıştır. Preparatlara safranin boyası ilave edilmiş ve 30- 60 saniye sonra distile su ile yıkanmıştır. Açık havada kurutulan preparatlar, mikroskop altında 100x’lik immersiyon objektifinde incelenmiştir. Pembe olarak boyanan kısımlar hücrenin vejetatif kısmı, yeşil renkli görünenler ise endosporlardır (Öner, 1984).
Kapsül Boyama
İzolatların kapsül yapısına sahip olup olmadıklarının belirlenmesi amacıyla, 24-48 saatlik kültürler kullanılmıştır. Bu kültürlerden, temiz bir lam üzerine yayma preparat hazırlanmıştır. Açık havada kuruması beklendikten sonra, üzerine kristal viyole boyası ilave edilmiş ve 5-7 dakika beklenmiştir. Daha sonra, boya % 20’lik CuSO₄ çözeltisi ile yıkanmış ve kuruduktan sonra, mikroskopta 100x’lik immersiyon objektifinde incelenmiştir. Bakteri hücresi etrafında şeffaf olarak parlayan kısımlar kapsül yapısı olarak kabul edilmiştir (Öner, 1984).

Flagella Boyama
İzolatların flagella yapılarının belirlenmesi amacıyla, 18-22 saatlik kültürler kullanılmıştır. Bu kültürlerden, steril saf su içerisinde seyreltik süspansiyon hazırlanır ve flagellanın tamamen uzayıp gelişmesi için 10-15 dakika uygun sıcaklıkta inkübe edilir. Daha sonra, bir öze dolusu süspansiyon temiz bir lamın ucuna konulur ve lam eğilerek damlacığın aşağı doğru akması sağlanır. Havada kurutulduktan sonra, lam, flagella mordantla taşırılır ve boya 10 dakika boyunca bakteriyal film üzerinde tutulur. Boya su ile durulanır. Ziehl’in karbolfuksini ile 5 dakika boyunca taşırılır ve sonra su ile tekrar durulanır. Havada kurutulduktan sonra, mikroskopta, 100x’lik immersiyon objektifinde incelenir (Öner, 1984)

Çukur lamda hareketlilik testi
İzolatların hareketli olup olmadıklarının anlaşılması için çukur lamda hareketlilik testi yapılmıştır. Bu amaçla, çukur lamın çukurluğunun etrafına vazelin sürülür. Temiz bir lamel üzerine 24 saatlik sıvı kültürden alınan küçük bir damla bakteri süspansiyonu koyup, çukur lamın çukur kısmı damlanın üzerine gelecek şekilde ters çevirilir ve lam ile çukur lamın birleşmesi sağlanır. Örnek yüksek güçlü kuru objektifte incelenir (Öner, 1984). Ayrıca izolatların hareketliliğini belirlemek amacıyla tüpte dik olarak dondurulmuş ve petride hazırlanan yarı katı Thermus ortamına 24 saatlik sıvı kültürlerinden ekim yapılmış ve aralıklarla gelişme örnekleri incelenmiştir.

2. 2. 3 İzolatların kültürel özelliklerinin belirlenmesi
İzolatların kültürel özelliklerinin belirlenmesi için petride, sıvı ortamda ve tüpte yatık olarak hazırlanmış katı Thermus ortamlarındaki üreme şekillerine bakılmıştır.


2. 2. 4 İzolatların biyokimyasal ve fizyolojik özelliklerinin belirlenmesi
İzolatların oksijen ilişkilerinin belirlenmesi
İzolatların oksijen ilişkilerini belirlemek amacıyla, Brain Heart İnfüzyon Agar hazırlanmıştır. Bu besiyeri, steril edildikten sonra, 50 C’ye kadar soğutulmuş ve 24 saatlik sıvı kültürlerden, birkaç öze dolusu alınarak, tüplere ekim yapılmıştır. Bir tüp kontrol olarak bırakılmıştır. Çevrilerek karıştırıldıktan sonra, tüpler hemen soğuk suya daldırılmış ve dik olarak donması sağlanmıştır. 65 °C’de, 24 saat inkübe edildikten sonra, izolatların üredikleri bölgeye bakılarak oksijen ihtiyaçları hakkında karar verilmiştir (Cappucino, 1992). Ayrıca, aynı amaçla ve aynı şekilde Yeast Tripton Glikoz Agar kullanılmıştır (Harley and Prescott, 1990).

Nişasta hidrolizi testi
Bu test, izolatların nişastayı parçalayan amilaz enzimine sahip olup olmadıklarının belirlenmesi için yapılmıştır. Bu amaçla, Thermus ortamına nişasta eklenerek petride hazırlanan nişastalı agara, izolatların 24 saatlik sıvı kültüründen çizgi ekim yapılmış ve 65 °C’de, 48 saat inkübe edildikten sonra, petrilerin üzerine nişastanın ayıracı olan iyot çözeltisinden dökülmüştür. Kolonilerin etrafında şeffaf bir zon oluşup oluşmadığına bakılarak değerlendirme yapılmıştır (Salle, 1967).

İndol testi
İndol, triptofan aminoasidinin triptofanaz enzimi ile parçalanması sonucu oluşan bir maddedir. İzolatların triptofanaz enzimine sahip olup olmadıklarını belirlemek amacıyla indol testi yapılmıştır. Bu amaçla hazırlanan, Tripton broth tüplerine, izolatların 24 saatlik sıvı kültürlerinden ekim yapılmış ve tüpler 65 °C’de 48 saat inkübe edilmiştir. İnkübasyon sonucunda, tüplere 0.5 ml Kovacs çözeltisinden eklenmiştir. Besiyerinin yüzeyinde pembe veya kırmızı renk oluşumu test için pozitif sonuçtur (Öner, 1984).
Voges-Proskauer testi
Voges-Proskauer testi, bakterilerin glikozu fermente etmesi sonucu, ortamda biriken nötral ürünlerin saptanması amacıyla yapılır. Bu test için hazırlanan VP brothlara, izolatların 24 saatlik yatık Thermus ortamındaki kültürlerinden ekim yapılmış ve uygun sıcaklıkta 48 saat inkübe edilmiştir. İnkübasyondan sonra, tüplere önce 0.5 ml -naftol çözeltisinden, daha sonra ise 0.5 ml % 40’ lık KOH çözeltisinden eklenmiş ve çalkalandıktan sonra 5- 10 dakika beklenmiştir. Kırmızı renge doğru bir pembeleşme, test için pozitif sonuçtur (Öner, 1984).

Nitrat indirgenmesi testi
İzolatların nitrataz enzimine sahip olup olmadıklarının belirlenmesi, ayrıca nitrattan oluşan son ürünlerin saptanması amacıyla, 24 saatlik yatık Thermus agardaki kültürlerden, içerisinde durheim tüpleri bulunan ve Thermus ortamına KNO3 eklenerek hazırlanmış Nitrat brothlara ekim yapılmış ve 65 °C’de 4- 6 gün inkübe edilmiştir. İkinci günden başlayarak inkübe edilmiş tüplerden steril pipetle 1’er ml alınarak, temiz test tüplerine aktarılmış ve bunların üzerine önce sulfanilik asit çözeltisinden 3 damla, daha sonra -naftol çözeltisinden 2 damla ilave edilmiştir. Pembemsi renk oluşumu, nitritler açısından pozitif sonuçtur. Nitritler için pozitif sonuç elde edildiğinde, tüpler yine bir iki gün inkübe edilmiş ve temiz test tüplerine 1’er ml alınarak üzerlerine birkaç damla Nessler çözeltisi damlatılmıştır. Ortamda sarımsı turuncu renk oluşumu NH₃ için pozitif sonuçtur. N₂ gazı oluşumu ise tüplerde bulunan durheim tüplerine bakılarak değerlendirilmiştir (Öner, 1984).


Sitokrom oksidaz testi
İzolatların sitokrom oksidaz enzim sistemlerini test etmek amacıyla, tetrametil p-fenilen diamin maddesinin % 1 lik çözeltisi kullanılmıştır. İzolatların, Thermus agar petrilerindeki 24 saatlik kültürlerinden platin öze ile bir miktar alınarak, bu çözeltinin emdirildiği filtre kağıtlarına yayılmıştır. 5- 10 saniye içindeki koyu mor renk oluşumu deney için pozitif sonuç olarak değerlendirilmiştir.
Karbohidratların fermentasyonu
İzolatların hangi karbohidratlarını fermente edebildiklerini ve de fermentasyon sonucu asit ve gaz oluşumlarını kontrol etmek amacıyla içinde durheim tüpleri bulunan (Thermus ortamlarına farklı karbohidratlar eklenerek) , sıvı karbohidrat ortamları hazırlanmıştır. Karbohidrat ve indikatör boya içeren sıvı ortamlara, izolatların 24 saatlik yatık ortamdaki kültürlerinden ekim yapılmış ve tüpler 65 °C’de, 48 saat inkübe edilmiştir. İnkübasyondan sonra ortamlardaki renk değişimleri (kırmızıdan sarıya dönüşüm) ve gaz oluşumları belirlenmiştir (Öner, 1984).

Üre hidrolizi testi
İzolatların üreaz enzimine sahip olup olmadıklarının belirlenmesi amacıyla yatık olarak hazırlanan üre agarlar kullanılmıştır. Bu testte izolatların 24 saatlik yatık Thermus agardaki kültürlerinden, üre agarlı tüplere, iğne ile ekim yapılmış ve 65 °C’de 1- 7 gün inkübe edilmişlerdir. İnkübasyon sonucunda ortamda bulunan fenol red indikatöründeki renk değişimi ( sarıdan kırmızıya dönüşüm ) pozitif sonuç olarak değerlendirilmiştir (Öner, 1984).

Katalaz testi
Katalaz, mikroorganizmaların oksijeni kullanmaları sonucu oluşan H₂O₂ ‘nin parçalanmasından sorumlu olan enzimdir. İzolatların bu enzime sahip olup olmadıklarının belirlenmesi amacıyla, 24 saatlik yatık Thermus ortamındaki kültürlerden, platin öze ile bir miktar alınarak, içerisinde H₂O₂ çözeltisi bulunan temiz test tüplerine daldırılmıştır. Katı materyal etrafında, gaz kabarcıklarının çıkması, test için pozitif sonuçtur. Katalaz aktivitesini belirlemek amacıyla aynı zamanda, H₂O₂ çözeltisi kültürler üzerine dökülmüş ve gaz kabarcıklarının oluşumu kontrol edilmiştir (Öner, 1984).
Sitrat testi
İzolatların sitratı karbon kaynağı olarak kullanıp kullanmadıklarının belirlenmesi amacıyla yatık olarak hazırlanan Simmon Sitrat Agar’lı tüplere, 24 saatlik kültürlerden iğne öze ile ekim yapılmıştır. 24- 48 saat boyunca 65 C’ de inkübasyondan sonra besiyerinin renginin yeşilden maviye dönmesi test için pozitif sonuçtur (Öner, 1984).

İzolatların büyüyebildikleri sıcaklık aralıklarının belirlenmesi
İzolatların büyüyebildikleri sıcaklık aralıklarının belirlenmesi için, yatık Thermus ortamlarına ekimler yapılmış ve farklı sıcaklıklarda ( 40, 45, 50, 55, 70, 75 C ) inkübe edilmiştir. İzolatlar, 30-50 C arasındaki sıcaklıklar için 5 gün; 50 C ve üzerindeki sıcaklıklar için ise 3 gün boyunca etüvde tutulmuştur (Sneath et al., 1986).
Ayrıca optimum büyüme sıcaklıklarının belirlenmesi için farklı sıcaklıklardaki (50, 55, 60, 65 ve 70 C) büyüme eğrileri çıkarılmıştır . Bu amaçla, izolatların sıvı Thermus ortamındaki gecelik kültürlerinden, 1 ml alınarak içerisinde 100 ml Thermus ortamı bulunan erlenlere ekim yapılmıştır. Daha sonra erlenler, çalkalamalı sıcak su banyosunda, test edilen sıcaklıklarda 24 saat boyunca inkübe edilmiş ve Shimadzu UV-1601 model spektrofotometrede 600 nm’de saat başı ölçüm yapılmıştır.

İzolatların büyüyebildikleri pH aralıklarının belirlenmesi
İzolatların büyüyebildikleri pH aralıklarının ve optimum pH değerlerinin belirlenmesi amacıyla farklı tamponlarla hazırlanan ( 5, 6, 7, 8, 9 pH değerlerindeki) Thermus ortamlarına, izolatların gecelik sıvı kültürlerinden ekimler yapılmıştır. Optimum sıcaklıkta 24-48 saatlik inkübasyondan sonra Shimadzu UV-1601 model spektrofotometrede 600 nm de ölçüm yapılmıştır (Harley and Prescott, 1990).

İzolatların büyüyebildikleri NaCl değerlerinin belirlenmesi
Bu amaçla farklı oranlarda NaCl (% 1; 2; 5; 7; 10) içeren sıvı Thermus ortamlarına, izolatların Thermus ortamındaki gecelik kültürlerinden ekim yapılmıştır. 24-48 saat 65 °C’de, inkübe edildikten sonra, Shimadzu UV-1601 model spektrofotometrede 600 nm de ölçüm yapılmıştır (Harley and Prescott, 1990).

3. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA


3. 1 Araştırma Bulguları

Bu araştırmada, Bozköy-Alangüllü kaplıcasında bulunan farklı iki kaynaktan su örnekleri alınmış ve sıcak su kaynağında bulunan termofilik bakterilerin izolasyonu ve tanısı amaçlanmıştır. Termofilik bakterilerin izolasyonunda, zenginleştirme amacıyla, özellikle organik madde içeriği düşük ortamlar kullanılmakta ve yüksek sıcaklık derecelerinde inkübe edilmektedirler (Brock and Freeze, 1969). Bu yüzden, izolasyonda ve daha sonraki aşamalarda Thermus ortamı kullanılmıştır. Bu ortam, organik madde açısından % 0.3 oranında tripton ve % 0.1 oranında maya özütü içermektedir. İlk olarak, su örneklerinden sıvı Thermus ortamlarına farklı miktarlarda ekimler yapılmış ve ortamlar farklı sıcaklıklarda (65, 70, 80 C) inkübe edilmiştir. 24-48 saat sonra, üreme gözlenen brothlardan, katı Thermus ortamlarına, yayma ekimler yapılmış ve beliren kolonilerden saf kültür elde etme amacıyla yayma ekimler tekrarlanmıştır. Petrilerde oluşan kolonilerin morfolojilerine ve gram boyanma özelliklerine bakılarak, bu kriterlere göre birbirinden farklı görünen 5 izolat seçilmiş ve bunların saf kültürleri elde edilmiştir.

Seçilen izolatların koloni morfolojilerine bakıldığında D3 izolatının mat, koyu krem, konsantrik koloniler oluşturduğu görülmüştür. Bu kolonilerin kenarları düzgün, kıvamı yapışkandır ve yassıdırlar. D4 ise mat, sarımtrak renkli, konsantrik ve kenarları düzgün, yapışkan kıvamlı koloniler oluşturmaktadır. 1 numaralı izolatın ise kolonileri, koyu krem, kenarları düzgün ve yarı şeffaf görünümlüdür, koloni kıvamı yapışkandır. 3 numaralı izolatın ise kolonileri şeffaf, parlak sarı, ortası koyu renkli ve hafifçe yaygındır, koloni kıvamı sıvımsıdır. 4 numaralı izolatın kolonileri ise, açık krem renkli, kenarları düzensiz ve yassıdır. Koloni morfolojileri belirlendikten sonra izolatların saf kültürlerinden, sıvı ortamda ve yatık ortamdaki üreme özellikleri de tespit edilmiştir.
Daha sonra, ayırdedilen beş izolatın taksonomik durumlarını belirlemek amacıyla, Bergey’in Sistematik Bakteriyoloji kriterlerine göre izolatlar incelenmiştir (Sneath et al. 1986).
Mikroorganizmaların tanısında, Gram boyanma özellikleri oldukça önemlidir. Gram boyama yöntemi ile mikroorganizmaların morfolojilerini de belirlemek mümkündür. Yapılan Gram boyamalar sonucunda, tüm izolatlar çubuk morfolojide olmakla birlikte, D3, D4, 1 ve 4 numaralı izolat bazen zincirler halinde görünmektedir. 3 numaralı izolat ise, daha uzun zincirler oluşturmaktadır ve ikili veya bitişik kümeler halinde bulunabilmektedir. Gram boyanma özellikleri açısından bakıldığında, D3, D4 ve 1 numaralı izolat gelişmenin erken evrelerinde gram pozitif boyanırken, 24 saatlik kültürlerinde gram değişken özellik göstermektedirler. 24 saatlik kültürlerinde, 3 numaralı izolat gram negatif, 4 numaralı izolat ise gram pozitif görünmektedir.
İzolatların Gram boyanma özellikleri belirlendikten sonra, endospor boyamaları yapılmıştır. Bu şekilde endosporların şekli ve hücre içindeki konumları görülebilmektedir. Malaşit yeşili ve safranin çözeltileri kullanılarak, 24-48 saatlik kültürlerden yapılan boyamalar sonucunda D3, D4, 1 ve 4 numaralı izolatlarda endospor oluşumu görülmüştür. Endosporlar tüm izolatlarda, terminal-subterminal konumlu ve oval şekillidir. Genelde hücre dışına çıkmış ve dağılmış halde görülmektedirler. 3 numaralı izolatta ise ilk başlarda yapılan boyamalarda endospora rastlanmamıştır. Bu izolat, mangan tuzlarının bulunduğu ortamda geliştirilmiş ve sonuçta terminal ve sentral endosporlara rastlanmıştır.
İzolatların kapsül oluşturup oluşturmadıklarını belirlemek amacıyla, 48-72 saatlik kültürlerden kapsül boyama yapılmıştır. Sonuçta D3 ve 4 numaralı izolat dışındakilerin kapsül oluşturmadığı belirlenmiştir.

Şekil 2. D3 izolatının sırasıyla, gram, endospor ve kapsül boyamaları (100x’lik immersiyon objektifinde). Çubuk 5 m’yi temsil etmektedir.

Şekil 3. D4 izolatının sırasıyla, gram, endospor ve kapsül boyamaları (100x’lik immersiyon objektifinde ). Çubuk 5 m’yi temsil etmektedir.

Şekil 4. 1numaralı izolatın sırasıyla, gram, endospor ve kapsül boyamaları (100x’lik immersiyon objektifinde ). Çubuk 5 m’yi temsil etmektedir.

Şekil 5.3 numaralı izolatın sırasıyla, gram, endospor ve kapsül boyamaları (100x’lik immersiyon objektifinde ). Çubuk 5 m’yi temsil etmektedir.

Şekil 6. 4 numaralı izolatın sırasıyla, gram, endospor ve kapsül boyamaları (100x’lik immersiyon objektifinde ). Çubuk 5 m’yi temsil etmektedir.

Hareketlilik ile ilgili deneylerde ise, çukur lamda hareketlilik kontrol edilmiştir. Fakat bu teknikle yapılan gözlemlerde, sıvı ortamdaki hareketler ile bakterilerin hareketi karıştırılabilmektedir. Bu yüzden aynı zamanda, yarı katı agarda hareketlilik kontrol edilmiştir. 3 numaralı izolatın hareketlilik özelliği aynı zamanda petride yarı-katı ortamda kontrol edilmiştir. Buna göre izolatlardan 4 numaralı izolat dışındakilerin tümünün hareketli olduğu gözlenmiştir (Çizelge 2).
Kültürel ve mikroskobik özelliklerin belirlenmesinden sonra, mikroorganizmaların tanısında önemli bir yere sahip olan ayırdedici biyokimyasal testler yapılmıştır. Ayrıca, izolatların fizyolojik özellikleri de araştırılmıştır. Tüm testler, iki tekrarlı ve kontrol grupları kullanılarak yapılmıştır.
Sıcaklık, pH, tuz konsantrasyonu gibi çeşitli parametreler mikroorganizmaların gelişimleri açısından önemli bir role sahiptir. İzolatların tolere edebildikleri sıcaklık, pH ve tuz konsantrasyonları, ayrıca bu özellikler açısından optimum olan şartlar araştırılmıştır. İzolatların yaşayabildikleri sıcaklık aralıklarına bakıldığında, D3, D4, 1 ve 4 numaralı izolat zayıf da olsa 40 C de gelişmektedir. Fakat 3 numaralı izolatın 40 C de gelişmediği görülmüştür. İzolatların tümü, maksimum 72-73 C’de gelişmektedirler. Çalkalamalı su banyosunda, büyüme eğrileri çıkarılarak yapılan optimizasyon çalışmalarına göre, tüm izolatlar optimum 65 C civarında gelişmektedir. Sıcaklık açısından optimum şartlar belirlenirken, 3 numaralı izolatta özellikle 5-6. saatten itibaren ipliksi yapılar oluştuğu gözlenmiştir. Bu yüzden bu saatlerden sonra, absorbans değerlerinde iniş çıkışlar görülmüştür. Grafikler değerlendirilirken, izolatların log fazına en çabuk ulaştıkları ve maksimum absorbans verdikleri sıcaklık değerleri optimum sıcaklık olarak değerlendirilmiştir. Ayrıca, yapılan ölçümlerde genelde 10. saatten sonra fazla bir değişiklik gözlenmediği için, son ölçümler 24. saatte alınmıştır.

İzolatların üreyebildikleri pH aralıkları ve gelişimleri açısından optimum olan pH değerleri de araştırılmıştır. Buna göre tüm izolatların geliştiği optimum pH 6’dır. pH 5 ve pH 9 değerlerinde gelişme gözlenmemiştir.

NaCl konsantrasyonu açısından izolatların büyüyebildikleri aralıklar belirlenirken önce % 1, % 2, % 5, % 7 ve % 10 oranında tuz içeren sıvı Thermus ortamlarındaki gelişimleri incelenmiştir. Sonuçta, yalnızca % 1 lik tuz değerlerinde üreyebildikleri görülmüştür. Daha sonra ise, gelişim açısından optimum tuz konsantrasyonunu belirlemek üzere, % 0.5, % 1, % 1.5 ve % 2 lik NaCl içeren ortamlar hazırlanmış ve bu ortamlardaki gelişim kontrol edilmiştir. Buna göre izolatların tümü optimum % 0.5 – 1 oranında tuz içeren ortamlarda üremişlerdir.
Mikroorganizmaların çeşitli enzim aktiviteleri, biyokimyasal testlerde temel olarak alınmaktadır. Nişasta hidrolizi açısından D3, D4, 1 ve 3 numaralı izolatlar pozitif sonuç verirken, 4 numaralı izolatta amilaz aktivitesine rastlanmamıştır.
Triptofanaz enziminin varlığını belirlemek amacıyla yapılan İndol testinde ise, tüm izolatların bu özellik açısından negatif oldukları görülmüştür. Voges- Proskauer testinde de izolatların hepsi negatif sonuç vermiştir.
Nitratların indirgenmesi de ayırdedici biyokimyasal testler arasında yer almaktadır. Mikroorganizmaların bazıları nitratı, nitrite ve bazen azot gazına kadar indirgerken, bazıları bu özelliklere sahip değildir. Bu aktivite açısından izolatlar araştırılmış ve 4 numaralı izolat dışında hepsinin nitratı azot gazına indirgediği bulunmuştur. 4 numaralı izolatta nitrit oluşumu vardır, fakat durheim tüplerine bakıldığında gaz oluşumu görülmemiştir.
Karbon kaynağı olarak sitratın kullanılıp kullanılmadığını belirlemek amacıyla yatık Simmon Sitrat Agar’lara yapılan ekimler sonucunda, tüplerin hiçbirinde renk değişimi görülmemiştir. Yani izolatların tümü bu özellik açısından negatif sonuç vermiştir.
Mikroorganizmaların tanısında, katalaz ve oksidaz aktivitelerinin belirlenmesi de oldukça büyük önem taşımaktadır. Yapılan testler sonucu izolatların tümünün hem katalaz, hem de oksidaz pozitif oldukları belirlenmiştir.
Karbohidratların fermentasyonu ile ilgili denemelerde, glikoz, arabinoz, ksiloz ve mannitol içeren ortamlar kullanılmıştır. Ortamdaki indikatörün rengi ve durheim tüpleri kontrol edilerek, hangi karbohidratların izolatlar tarafından kullanıldığına, karar verilmiştir. Buna göre, tüm izolatlar, glikozdan asit oluşturmaktadır, fakat glikoz fermentasyon ortamlarının hiçbirinde gaz oluşumu görülmemiştir. D3, D4, 1 ve 3 numaralı izolat ksiloz fermentasyonu açısından pozitif iken, 4 numaralı izolat negatiftir. İzolatların hiçbiri arabinozu fermente etmemiştir. D4 ve 3 numaralı izolat dışındakiler mannitolü fermente etme yeteneğindedirler.
Yapılan tüm denemeler boyunca izolatlar aerobik olarak gelişmiştir. Fakat yine de oksijen ilişkilerini saptamak amacıyla Brain Heart İnfüzyon Agar’da ve YTA ortamında üreme özellikleri test edilmiştir. 3 numaralı izolatın Brain Heart İnfuzyon Agar’da gelişme özelliği saptanamamıştır, diğer tüm izolatlar bu ortamda tüpün üst kısmında yoğun bir gelişme göstermişlerdir. YTA ortamlarında yapılan denemeler sonucunda ise izolatların tümünün aerobik olduğu görülmüştür.
Üre hidrolizini test etmek amacıyla ise, yatık üre agar kullanılmıştır. 48 saatlik inkübasyon sonucunda üre ortamındaki renk değişimine bakılarak, 3 numaralı izolat dışındakilerin tümü, bu özellik açısından negatif olarak belirlenmiştir. D3, D4, 1 ve 4 numaralı izolatların üreyi hidroliz etme yeteneğinde olmadıkları görülmüştür. 3 numaralı izolat ise üreaz enzimine sahiptir.
Bu bulgular sonucu, izolatların Bacillus stearothermophilus’a oldukça yakın türler oldukları kanaatine varılmıştır. İzolatlar ile Bacillus stearothermophilus’un çeşitli özellikleri Çizelge 3’de karşılaştırılmıştır.
Çizelge 3. D3, D4, 1, 3 ve 4 numaralı izolatlar ile Bacillus stearothermophilus’un karşılaştırılması (d: soyların % 11-89’u pozitif, ND: kullanabilecek veri yok, Z: zayıf gelişim )

	B.stearothermophilus	D3	D4	1	4	3
Hücre çapı >1.0m	_	_	_	_	_	_
Sporlar yuvarlak	_	_	_	_	_	_
Sporangium şişkin	+	+	+	+	+	+
Parasporal kristaller	_	_	_	_	_	_
Katalaz	d	+	+	+	+	+
VP testi	_	_	_	_	_	_
VP Broth’daki pH <6	+	+	+	+	+	+
VP broth’daki pH> 7	_	_	_	_	_	_
D-glikozdan asit	+	+	+	+	+	+
L-arabinozdan asit	d	_	_	_	_	_
D-ksilozdan asit	d	+	+	+	_	+
D-mannitolden asit	d	+	_	_	_	+
Glikozdan gaz	_	_	_	_	_	_
Nişasta hidrolizi	+	+	+	+	_	+
Sitrat kullanımı	d	_	_	_	_	_
Nitratı nitrite indirgeme	d	+	+	+	+	+
İndol testi	_	_	_	_	_	_