Masarykova univerzita přírodovědecká fakulta

Test estrogenity cisEHMC a standardu EHMC na buněčných liniích MVLN

Test byl proveden na mikrodestičkách v triplikátu pro každou koncentraci vzorku. Buňky byly vystaveny po dobu 24 hodin solventové kontrole (0,5% DMSO), sérii ředění 17βestradiolu a sérii ředění vzorku cisEHMC a neozářeného standardu EHMC.

Vzorky o koncentraci 800 mg.ml¹ byly naředěny 200x pomocí DMSO (kvůli zjištění cytotoxického efektu ve vyšších koncentracích z dřívějších testů) a poté byla provedena ředící řada o šesti koncentracích v ředícím poměru 1:2 (EHMC:DMSO). Test provedl Mgr. Jiří Novák. Ph.D. Cytotoxicita zkoumaných vzorků byla stanovena pomocí testu s neutrální červení.

Graf 27: Znázorňuje závislost relativní luminiscenční jednotky na koncentraci [pM] 17βestradiolu (červená křivka), koncentraci [μM] neozářeného standardu (fialová křivka) a cisEHMC (zelená křivka).

Test na buněčných liniích MVLN nevykázal žádný estrogenní potenciál u vzorků EHMC a vyizolovaného cisEHMC. Obě látky měly v nejvyšší koncentraci 68,9 µM cytotoxický efekt.

2. Test estrogenity cisEHMC a standardu EHMC na buněčných liniích HeLa9903

Test byl proveden na mikrodestičkách v triplikátu pro každou koncentraci vzorku. Buňky byly vystaveny po dobu 24 hodin negativní kontrole (0,5% DMSO), sérii ředění 17βestradiolu a sérii ředění vzorku cisEHMC a neozářeného standardu EHMC.

Vzorky o koncentraci 800 mg.ml¹ byly naředěny 200x pomocí DMSO (kvůli zjištění cytotoxického efektu ve vyšších koncentracích z dřívějších testů) a poté byla provedena ředící řada o šesti koncentracích v ředícím poměru 1:2 (EHMC:DMSO).

Test provedl Mgr. Jiří Novák. Ph.D.


Graf 28: Znázorňuje závislost relativní luminiscenční jednotky na koncentraci [pM] 17βestradiolu (červená křivka), koncentraci [μM] neozářeného standardu (fialová křivka) a cisEHMC (zelená křivka).

Test na buněčných liniích HeLa9903 nevykázal žádný estrogenní potenciál u vzorků EHMC a vyizolovaného cisEHMC. Tyto látky nevykázaly cytotoxický efekt v žádné koncentraci.

Ačkoliv EHMC vykázal v řadě testů estrogenní účinky (Schlumpf et al. 2001; Schreurs et al. 2002; Seidlova-Wuttke et al. 2006a; Seidlova-Wuttke et al. 2006b) v testech na buňkách MVLN a HeLa9903 v laboratoři RECETOX se tyto účinky nepotvrdily.

Test provedený v naší laboratoři je založen na sledování genové exprese genů, které jsou napojeny na estrogenní receptor. Luminiscence vyvolaná luciferázou, která je produkována reportérovým genem MVLN buněk, je detekována pomocí luminometru. Naproti tomu Schlupf et al. 2001 používá pro testování estrogenity Escreen, ve kterém se sleduje proliferace buněk MCF7 v závislosti na aktivitě estrogenní látky pomocí spektrofotometru. Můžeme tedy říci, že tyto testy oba detekují estrogenní potenciál látek, ale na jiném principu. Další rozdíl v těchto testech je jiný výrobce, od kterého byla látka EHMC poskytnuta. V našem případě se jedná o látku EHMC (SigmaAldrich 78848, CZ), kdežto v testu Schlumpf et al. 2001 byl použit standard EHMC (Eusolex 2292). V dalších výše zmíněných testech estrogenity (Schreurs et al. 2002; SeidlovaWuttke et al. 2006a i 2006b), kdy EHMC vykázalo estrogenní potenciál, byl rovněž použit EHMC (Eusolex 2292). Dalším krokem při studiu estrogenního potenciálu této látky by tedy mělo být použití stejného standardu od stejného výrobce v propojení s naší přípravou cisisomeru, jeho separací ze směsi a testování na MCF7 buňkách pomocí Escreen testu.

2. Analýza rizik EHMC a dalších sunscreenů

V této kapitole jsou popsány rizikové scénáře při používání UV filtrů pro látky EHMC, BP3 a 4MBC.

1. Výpočet CDI (Chronic Daily Intake)

CDI lze odhadnout na základě procentuálního podílu lokálně aplikované dávky, která prostupuje kůži. Pokud je známo procento průniku (Perm [%]), koncentrace aplikovaná na kůži (CA, např. v mg.cm²), četnost aplikace za den (n_app), postižené místo kůže a hmotnost osoby, pak CDI lze odhadnout pomocí následující rovnice:

Perm procento sledované látky, které projde přes kůži z celého obsahu krému, který je aplikován

CA množství aplikovaného krému na kůži [mg.cm²]

n_app četnost aplikace za den

SA povrch kůže dostupný pro kontakt [cm²]

EF četnost expozice [dnů.rok¹]

ED trvání expozice [roků]

BW tělesná hmotnost [kg]

AT přepočet na časový průměr [dny]

Perm

Pro EHMC je stanoven přestup přes kůži méně než 3 % (NTP 2008). Experimentálně byl zjištěn i vyšší přestup přes kůži (2,98 ± 0,38 %), který byl naměřen metodou ex vivo při použití Franzovy difúzní cely na kůži myších mláďat (Klinubol et al. 2008). Proto byla pro výpočet analýzy rizik použita hodnota 3 % pro EHMC. Pro 4MBC byla použita hodnota 1,9 % (Soeborg et al. 2007) a pro BP3 4 % (SCCP 2008). Obě tyto hodnoty vychází z experimentu permeace přes prasečí kůži in vitro.

Maximální povolené množství v kosmetických produktech v Evropě je 10 % pro EHMC (Giokas et al. 2007), 6 % pro BP3 (SCCP 2008) a 4 % pro 4MBC (Rastogi 2002). Z toho plyne, že 0,3 % EHMC, 0,24 % BP3 a 0,076 % 4MBC z celkového množství opalovacího krému, který je nanesen na kůži, může být vstřebáno do těla.

CA

Použití ochranných krémů proti slunečnímu záření je považováno za důležité pro snížení poškození kůže vyvolané působením ultrafialového záření ze slunečního světla. Použití krému je založena na jednotné aplikační tloušťce 2 mg.cm² (Stokes and Diffey 1997).

n_app

U opalovacích krémů předpokládáme obnovování nanesené vrstvy krému pro dostatečnou ochranu kůže během celého dne. Pro opalovací krémy se používá standardně frekvence aplikace 2x za den (Soeborg et al. 2007).

SA

Plocha kůže člověka je závislá na pohlaví a na věku jedince. Celková plocha dospělého člověka se pohybuje v rozmezí 1,5 až 2 m². Pro ošetřování a aplikace krémů kůže se počítá s 83 % celkové plochy kůže (Soeborg et al. 2007).

Tabulka 11: Plocha celkového povrchu těla, které je možné ošetřovat ochrannými krémy.

EF

Počet slunečných dní v ČR za rok se pohybuje kolem 40 dní.

Mezi nejteplejší místa v Evropě patří i Chorvatsko. Zde mezi měsíci květen až září je až 61,25 slunečních dní.

Na nejteplejším ostrově Řecka – Rhodos je denní počet slunečních hodin 11 v měsících květen až září. Denně by to tedy bylo necelých 69 hodin slunečního svitu.

BW

Tabulka 12: Průměrné hmotnosti dle věku a pohlaví.

Výpočet CDI pro EHMC:

Výpočet CDI pro BP3:

Výpočet CDI pro 4MBC:

2. Výsledky a diskuze analýzy rizik

V této kapitole jsou shrnuty výsledky analýzy rizik pro různé scénáře. Pro každý UV filtr byl vypočítán HI (hazard index) na základě průměrných hodnot, které se pro výpočet rizik dermální expozice běžně používají: 70 kg, 70 let, plocha kůže 15000 cm². Pro tento výpočet byly použity dvě varianty. První je výpočet pro obyvatele ČR, kde je mnohem méně slunečných teplých dní a jako druhá varianta je výpočet pro obyvatele Austrálie, kde je počet slunečních dní za rok mnohem vyšší. Další scénáře byly provedeny na základě různých věkových kategorií, v závislosti na pohlaví a tudíž rozdílnou tělesnou váhu a plochu ošetřované kůže.

Pokud je HI > 1, můžeme daný scénář označit za rizikový.

1. EHMC

Pro EHMC byla vypočítána RfD na základě stanovené NOAEL 450 mg.kg¹.den¹ z dvougeneračního testu reprodukční toxicity na potkanech při dietární expozici. Bez pozorovaného nepříznivého účinku na plodnost a reprodukční parametry, na systémovou a vývojovou toxicitu byla stanovena koncentrace 450 mg.kg¹.den¹ (Schneider et al. 2005). Pro výpočet byl použit faktor nejistoty (UF) = 1000.

UF = 10 ... NOAEL bylo odvozeno z testu reprodukční toxicity

UF = 10 ... extrapolace ze zvířat na člověka

UF = 10 ... ochrana citlivých jedinců

Z výsledků analýzy rizik pro EHMC můžeme vidět, že rizikové scénáře byly pouze u obyvatel Austrálie, kdy je pravděpodobné, že lidé mohou být vystaveni slunci mnohem častěji a musí se proto více chránit před škodlivým UV zářením (tab. 13, 16, 17). Hazard index se blížil k hodnotě 1 také v případě obyvatel ČR u nejmladších dětí (3 až 6 let). V případě chlapců byla tato hodnota 0,968 a v případě dívek dokonce 0,985. V případě malých dětí by se mělo uvažovat o možnosti, že látka může přes kůži procházet ve větším množství, jelikož malé děti nemají tak silnou zrohovatělou vrstvu pokožky. Proto EHMC, které zůstává převážně ve stratum corneum by mohlo snadněji procházet do nižších vrstev dermis a následně do těla (NTP 2008).

Tabulka 13: Výpočet CDI a HI pro průměrného obyvatele ČR a Austrálie. Rizikové scénáře jsou označeny červeně.



Tabulka 14: Výpočet CDI a HI pro obyvatele ČR mužského pohlaví v závislosti na věku. Průměrné hodnoty (označené tučným písmem) jsou vypočítány průměrem z jednotlivých hodnot CDI, HI pro různé věkové kategorie.



Tabulka 15: Výpočet CDI a HI pro obyvatele ČR ženského pohlaví v závislosti na věku. Průměrné hodnoty (označené tučným písmem) jsou vypočítány průměrem z jednotlivých hodnot CDI, HI pro různé věkové kategorie.



Tabulka 16: Výpočet CDI a HI pro obyvatele Austrálie mužského pohlaví v závislosti na věku. Průměrné hodnoty (označené tučným písmem) jsou vypočítány průměrem z jednotlivých hodnot CDI, HI pro různé věkové kategorie. Rizikové scénáře jsou označeny červeně.



Tabulka 17: Výpočet CDI a HI pro obyvatele Austrálie ženského pohlaví v závislosti na věku. Průměrné hodnoty (označené tučným písmem) jsou vypočítány průměrem z jednotlivých hodnot CDI, HI pro různé věkové kategorie. Rizikové scénáře jsou označeny červeně.

2. 4MBC

4methylbenzyliden camphor (4MBC) se používá v kosmetickém průmyslu pro jeho schopnost chránit pokožku před UV zářením, konkrétně v oblasti UVB. Najdeme ho na etiketách přípravků pod obchodními názvy, jako jsou Eusolex 6300 nebo Parosol 5000. 4MBC je prokazatelným endokrinním disruptorem (Durrer et al. 2007; Maerkel et al. 2007; Schlumpf et al. 2001; Seidlova-Wuttke et al. 2006a) a může mít vliv také na hypofýzu štítné žlázy, což může vést k hypotyreóze (Gotthardt et al. 2007; Schmutzler et al. 2004). Při použití této látky byly zjištěny také behaviorální změny u samic potkanů (Faass et al. 2009).

4MBC je schválen pro používání v Evropě, v Kanadě, ale není schválen například v USA či v Japonsku.

Pro 4MBC byla vypočítána RfD na základě stanovené NOAEL 10 mg.kg¹.den¹ z chronického testu reprodukční toxicity na potkanech (SCCNFP 1998). Pro výpočet byl použit faktor nejistoty (UF) = 100.

UF = 10 ... extrapolace ze zvířat na člověka

UF = 10 ... ochrana citlivých jedinců

Při zjišťování humánních rizik dermální expozice u látky 4MBC, byla zjištěna rizika pro obyvatele Austrálie ve věku od tří let až do dospělosti. Pro obyvatele ČR bylo zjištěno riziko u nejmladších dětí ve věku tři až šest let. Pro obyvatele Austrálie je riziko větší, neboť je zde ročně mnohem více slunečních dní a opalovací krémy mohou být častěji používány pro ochranu před škodlivým UV zářením.

4MBC je povoleno v opalovacích krémech jen ve velmi malém množství na rozdíl od EHMC, či BP3 (pouze 4 % (Rastogi 2002)). Dříve byla tato látka povolena v kosmetických přípravcích až v množství 6 % (Gagliardi et al. 1987; Lowe 1998), v dnešní době je však koncentrace této látky zpřísněna na 4 %. Důvodem může být jeho vyšší estrogenní potenciál (Schlumpf et al. 2001) a jiné nepříznivé účinky, které byly popsány výše. Dále je tato látka jen velmi málo prostupná přes kůži (pouze 1,9 % (Soeborg et al. 2007)), což celkové riziko také velmi snižuje.

Tabulka 18: Výpočet CDI a HI pro průměrného obyvatele ČR a Austrálie. Rizikové scénáře jsou označeny červeně.



Tabulka 19: Výpočet CDI a HI pro obyvatele ČR mužského pohlaví v závislosti na věku. Průměrné hodnoty (označené tučným písmem) jsou vypočítány průměrem z jednotlivých hodnot CDI, HI pro různé věkové kategorie. Rizikové scénáře jsou označeny červeně.



Tabulka 20: Výpočet CDI a HI pro obyvatele ČR ženského pohlaví v závislosti na věku. Průměrné hodnoty (označené tučným písmem) jsou vypočítány průměrem z jednotlivých hodnot CDI, HI pro různé věkové kategorie. Rizikové scénáře jsou označeny červeně.



Tabulka 21: Výpočet CDI a HI pro obyvatele Austrálie mužského pohlaví v závislosti na věku. Průměrné hodnoty (označené tučným písmem) jsou vypočítány průměrem z jednotlivých hodnot CDI, HI pro různé věkové kategorie. Rizikové scénáře jsou označeny červeně.



Tabulka 22: Výpočet CDI a HI pro obyvatele Austrálie ženského pohlaví v závislosti na věku. Průměrné hodnoty (označené tučným písmem) jsou vypočítány průměrem z jednotlivých hodnot CDI, HI pro různé věkové kategorie. Rizikové scénáře jsou označeny červeně.

3. BP3

Benzophenone3 je UV filtr působící v rozsahu UVB i krátkého UVA záření (UVAII). Používá se v opalovacích krémech vždy spolu s jiným sunscreenem, jelikož jeho účinnost ochrany před UVzářením je slabá. Byl u něj zjištěn vliv působící hormonální poruchy (Ma et al. 2003; Schlumpf et al. 2001; Schreurs et al. 2005), byly prokázány účinky na reprodukci a na změnu hmotnosti orgánů v chronickém testu (NTP 1992). Byla prokázána vysoká míra fotoalergie (Rodriguez et al. 2006).

Pro BP3 byla vypočítána RfD na základě stanovené NOAEL 200 mg.kg¹.den¹ pro vývojovou toxicitu z teratogenního testu na potkanech (SCCP 2008). Pro výpočet byl použit faktor nejistoty (UF) = 1000.

UF = 10 ... NOAEL byla odvozena ze subchronického testu

UF = 10 ... extrapolace ze zvířat na člověka

UF = 10 ... ochrana citlivých jedinců

Analýza rizik pro UV filtr BP3 vykázala riziko pro všechny scénáře. Tato látka může procházet přes kůži ve 3 až 4 % (SCCP 2008) a její estrogenní potenciál není rovněž zanedbatelný (Schlumpf et al. 2001). Množství látky přestupující přes kůži je v případě BP-3 nejvíce diskutované a v řadě testů byla penetrace přes kůži zcela odlišná. Hodnota 3 až 4 % je stanovena evropskou komisí a vychází z experimentálního stanovení in vitro na prasečí kůži. Z experimentů při aplikaci na lidskou kůži však byla pozorována velká variabilita v penetraci přes kůži (Gonzalez et al. 2006). U 18 dobrovolníků bylo v moči detekováno až 8,7 % BP3 po opakované dermální aplikaci 2 mg.cm². Na základě některých toxikologických informací a výsledků prostupnosti přes kůži zpřísnila SCCP v roce 2008 povolené množství tohoto UV filtru v opalovacích krémech z 10 % na 6 % (SCCP 2008). V této analýze rizik jsme pracovali s hodnotou 6 % pro maximální povolené množství látky v kosmetických přípravcích a s hodnotou 4 % pro prostupnost přes kůži. Obě tyto hodnoty vycházejí z Evropské komise (SCCP 2008) a už v tomto scénáři vykázalo BP3 rizika pro všechny varianty obyvatel. Pokud bychom počítali s permeací až 8,7 % aplikované dávky, mohly by být rizikové indexy mnohem vyšší. U dětí do 6 let v ČR by hazard index překročil hodnotu 3, v případě dětí do 6 let v Austrálii až HI > 6. Penetrace této látky v souvislosti s humánními riziky by měla být více prozkoumána.

Tabulka 23: Výpočet CDI a HI pro průměrného obyvatele ČR a Austrálie. Rizikové scénáře jsou označeny červeně.



Tabulka 24: Výpočet CDI a HI pro obyvatele ČR mužského pohlaví v závislosti na věku. Průměrné hodnoty (označené tučným písmem) jsou vypočítány průměrem z jednotlivých hodnot CDI, HI pro různé věkové kategorie. Rizikové scénáře jsou označeny červeně.



Tabulka 25: Výpočet CDI a HI pro obyvatele ČR ženského pohlaví v závislosti na věku. Průměrné hodnoty (označené tučným písmem) jsou vypočítány průměrem z jednotlivých hodnot CDI, HI pro různé věkové kategorie. Rizikové scénáře jsou označeny červeně.



Tabulka 26: Výpočet CDI a HI pro obyvatele Austrálie mužského pohlaví v závislosti na věku. Průměrné hodnoty (označené tučným písmem) jsou vypočítány průměrem z jednotlivých hodnot CDI, HI pro různé věkové kategorie. Rizikové scénáře jsou označeny červeně.



Tabulka 27: Výpočet CDI a HI pro obyvatele Austrálie ženského pohlaví v závislosti na věku. Průměrné hodnoty (označené tučným písmem) jsou vypočítány průměrem z jednotlivých hodnot CDI, HI pro různé věkové kategorie. Rizikové scénáře jsou označeny červeně.


Při hodnocení humánních rizik jsme vycházeli z experimentů, které byly provedeny in vitro na prasečí kůži (pro 4MBC a BP3 byly stanoveny hodnoty 1,9 % a 3 až 4 %). V případě BP3 se objevují také testy prostupu přes lidskou kůži s detekcí UV filtru v moči (Gonzalez et al. 2006). V tomto případě byla však zaznamenána velká variance v množství detekované látky v moči. V případě EHMC bylo experimentálně zjištěno, že látka může procházet přes kůži ve více než 3 % (Klinubol et al. 2008) Experiment byl proveden ex vivo na lidské kůži a tato hodnota je vyšší než udává jiná literatura (Huong et al. 2007; NTP 2008).

Jelikož se v literatuře objevují rozdíly v prostupnosti sunscreenů přes pokožku, chtěla bych se v navazující práci, která bude předmětem mého doktorského studia, zaměřit na rozdíly v penetraci této látky přes lidskou kůži rovněž ex vivo pomocí metody Franzovy cely. Do této studie bych chtěla zahrnout srovnání prostupu přes kůži cisEHMC a transEHMC.

Ve studiích penetrace látek přes kůži je opomenut důležitý faktor, který by mohl rychlost penetrace ovlivnit, a to depilace a holení pokožky. Holení a depilace kůže je nezbytnou estetickou úpravou zejména v letních měsících a je tedy úzce spjato právě s používáním opalovacích krémů a expozici na slunci. Pokud je opalovací krém aplikován na oholenou kůži, mohlo by to ovlivnit rychlost penetrace a množství absorbované látky přes kůži. Tato hypotéza byla prokázána ve studii dermální absorpce trifenylmethanového barviva Brilliant Blue a Patent Blue přes neporušenou a oholenou kůži (Lucova et al. 2013). Kdy bylo zjištěno, že normální proces holení výrazně zvyšuje potenciál systémové dostupnosti, což může být alarmující s přihlédnutím k frekvenci ošetření pleti po holení a depilaci kosmetickými prostředky obsahující barviva, které se běžně používají již několik let. Zvýšený potenciál prostupnosti přes oholenou kůži je způsoben zejména tím, že běžným holením se narušuje stratum corneum, která je hlavní bariérou pro vstup látek dermální cestou (Bommannan et al. 1990). Proto by bylo dobré do experimentů se sunscreeny zahrnout také srovnání prostupnosti přes oholenou kůži.