Masarykova univerzita přírodovědecká fakulta

Testy estrogenního potenciálu

1. Test na buněčných liniích MVLN

Estrogenní účinky byly zkoumány na buněčné linii MVLN, která je odvozena od linie MCF7. Jedná se o buňky lidského karcinomu prsu, které jsou transfekovány luciferázovým genem, který je pod kontrolou estrogenního receptoru (ER) (Demirpence et al. 1993; Freyberger and Schmuck 2005; Villeneuve et al. 2002). ERspecifická transkripční aktivita je přímo spojená se syntézou luciferázy, jejíž aktivita je stanovována luminiscenčně.

Buňky byly pěstovány v DMEM médiu bez fenolové červeně (PAA, Rakousko) s přídavkem 10% fetálního hovězího séra (PAA, Rakousko) při 37 °C, 5% hladině CO₂ v atmosféře a vysoké relativní vlhkosti. Buňky byly exponovány v 96jamkové mikrodestičce v DMEM bez fenolové červeně s přídavkem 5% dialyzovaného FBS, které bylo dodatečně ošetřeno suspenzí aktivního uhlí (SigmaAldrich, CZ) z důvodu odstranění interferujících látek (estrogenních hormonů) přirozeně obsažených v séru. 17βestradiol (E2) slouží jako referenční estrogenní sloučenina.

Buňky MVLN jsou exponovány po dobu 24 hodin negativní kontrole (0,5% DMSO), sérii ředění příslušné referenční sloučenině a sérii ředění testovaných vzorků.

Účinky vzorků na buňkách MVLN jsou hodnoceny v přítomnosti nebo nepřítomnosti konkurenčního endogenního ligandu. Luminiscence vyvolaná luciferázou, která je produkován reportérovým genem MVLN buněk, je detekován po 24 hodinové expozici použitím SteadyGlo® luciferasového kitu (Promega, Madison, WI, USA) dle instrukcí výrobce pomocí luminometru Synergy Mx (Biotek, USA).

2. Test na buněčných liniích HeLa9903

Estrogenní účinky byly zkoumány také na buněčné linii HeLa9903; lidských buněk karcinomu děložního čípku, které jsou transfekovány luciferázovým genem pod kontrolou aktivace estrogenního receptoru (Ono 2012). Test se provádí na mikrodestičkách v triplikátu pro každou koncentraci vzorku. Buňky HeLa9903 jsou exponovány po dobu 24 hodin negativní kontrole (0,5% DMSO), sérii ředění příslušné referenční sloučenině a sérii ředění testovaných vzorků.

Buňky jsou kultivovány a exponovány v DMEM médiu bez fenolové červeně (PAA, Rakousko) s přídavkem 10% fetálního hovězího séra (PAA, Rakousko), které bylo dodatečně ošetřeno suspenzí aktivního uhlí, aby byla snížena úroveň rušivých steroidů (SigmaAldrich, CZ).

Účinky vzorků na buňkách MVLN jsou hodnoceny v přítomnosti nebo nepřítomnosti konkurenčního endogenního ligandu. Luminiscence vyvolaná luciferázou, která je produkován reportérovým genem MVLN buněk, je detekován po 24 hodinové expozici použitím SteadyGlo® luciferasového kitu (Promega, Madison, WI, USA) dle instrukcí výrobce pomocí luminometru Synergy Mx (Biotek, USA).

4.Výsledky a diskuze

2. Ozařování a fotoprodukty látky EHMC

Absorpční spektra cis a transisomeru EHMC se liší a aby bylo dosaženo co nejúčinnějšího ozáření a získání co největšího výtěžku fotoproduktu cisEHMC, byl použit filtr připravený z roztoku skalice modré (CuSO₄ . 5H₂O, c = 250 g.l¹), který filtruje UV záření až do vlnové délky 310 nm (Murov et al. 1993).

EHMC byl ozařován UV lampou 400 W, která byla vložena do chladícího válce. V její bezprostřední blízkosti byl umístěn vzorek rozpuštěný ve vhodném rozpouštědle. Pro náš experiment byla použita dvě rozpouštědla: hexan a acetonitril. Z důvodu vyšších výtěžků cisisomeru byl zvolen acetonitril.

Důvodem použití roztoku skalice modré tedy bylo docílit ozařování EHMC ve vlnových délkách, kdy se od sebe jednotlivé isomery nejvíce liší. Vycházeli jsme z naměřených hodnot absorpčních maxim, které byly změřeny pomocí UV detektoru při HPLC analýze v acetonitrilu. Absorpční spektra jsou uvedena na obrázku 8.


Obr. 8: Absorpční spektra cisEHMC a transEHMC v acetonitrilu (po době ozáření 300 min). Ozařovaná směs byla připravena rozpuštěním 110 µl EHMC v 55 ml ACN. Směs byla analyzována pomocí HPLCDAD (MF: 65 % ACN ku 35 % H₂O, nástřik 3 µl). Směs isomerů byla v poměru 43 % cisEHMC ku 57 % transEHMC.

Roztok skalice modré byl nalit do pláště kolem UVlampy. Byl připraven vzorek rozpuštěním 400 µl EHMC v acetonitrilu a vložen do 100 ml baňky, směs byla neustále promíchávána pomocí magnetické míchačky, byla kontrolována teplota (24 °C) a pravidelné odběry byly analyzovány na GCFID. Aparatura je zobrazena na obrázku 9.


Obr. 9: snímek pořízený při samotném ozařování roztoku EHMC.
Proces ozařování se při použití filtru ze skalice modré velmi zpomalil, a proto byl filtr posléze odstraněn. Vývoj obsahu cis a transisomeru ve vzorku je zobrazen v grafech 19 a 20.



Graf 19 a 20: Modře je znázorněn průběh ozařování s použitím roztoku skalice modré, jako filtru, červeně pak průběh ozařování po odejmutí filtru.

Konečný výtěžek cisisomeru ve směsi byl 42,59 %. Samotný cisisomer byl poté separován pomocí kolonové chromatografie.

2. Separace cisisomeru

   1. Chromatografie na tenké vrstvě

Tato metoda byla použita jako preparativní pomůcka pro výběr vhodného složení eluentu pro metodu kolonové chromatografie. Vzorky byly nanášeny pomocí kapiláry v podobě malých skvrn (teček) na start chromatogramu. Zcela vlevo (i) byl nanesen roztok standardu EHMC, který obsahuje téměř výhradně transisomer. Na pravý okraj chromatogramu (iii) byl nanesen roztok ozářeného EHMC, obsahující 42,6 % cisisomeru a 57,4 % transisomeru. Doprostřed byla nakapána směs zmíněných dvou směsí přibližně ve stejném poměru (ii).

Destička byla poté vložena do kádinky se směsí rozpouštědel. Vyhodnocení bylo provedeno pomocí UV lampy. Cílem bylo zjistit, v jakém rozpouštědle se budou složky ozářeného vzorku EHMC nejlépe dělit. Při použití samotného DCM se látky dělily ve velké blízkosti čela a skvrny nebyly dost dobře oddělené (obrázek 10). Přidáním hexanu v poměru 2:1 (DCM:hexan) došlo k oddělení cisEHMC, transEHMC a k lepšímu oddělení nečistot (obrázek 11, 12). Při zvýšení poměru na 1:1 (DCM:hexan), došlo k výraznějšímu slití skvrn, které odpovídaly jednotlivým složkám (obrázek 13). Pro kolonovou chromatografii jsme tedy použili poměr DCM:hexan (2:1).

Obr. 10: Rozpouštědlo DCM.

Vlevo je roztok standardu EHMC (i). Můžeme zde vidět rozdělení na dvě frakce (větší skvrna odpovídá transEHMC, menší odpovídá nečistotám obsaženým v roztoku)

Další skvrna je smíchána z roztoku standardu EHMC a ozářené směsi EHMC (ii). Můžeme zde vidět rozdělení na tři skvrny, kdy nejblíže k čelu migrovaly nečistoty obsažené v roztoku, dále isomer cisEHMC a poslední isomer transEHMC. Zcela vpravo je ozářená směs EHMC s vyšším podílem isomeru cis, frakce se opět rozdělily na nečistoty, cisEHMC a transEHMC.


Obr. 11, 12: Rozpouštědlo DCM:hexan (2:1).

Snímek načrtnutých skvrn (vlevo) a snímek pod UV lampou (vpravo). Pořadí nanášení a jejich popis je stejné jako u chromatografie na obrázku 10.

Obr. 13: Rozpouštědlo DCM:hexan (1:1). Vývoj chromatografie pouze roztoku ozářené směsi EHMC).

2. Kolonová chromatografie

Do skleněné kolony byl vložen smotek vaty a převrstven mořským pískem. Byla připravena suspenze smícháním 150 g silikagelu s rozpouštědlem a pečlivě promíchána v ultrazvukové lázni. Suspenze pak byla nalita opatrně do kolony a poté převrstvena pískem, aby nedocházelo k narušení vrstvy naneseného vzorku při opětovném přidávání mobilní fáze. Zakoncentrovaný vzorek byl rozpuštěn v malém množství rozpouštědla a poté nakapán v souvislé vrstvě na písek. Vrstva byla přelita větším množstvím mobilní fáze. Pro zrychlení průběhu separace byl později zvýšen poměr mobilní fáze na 5:1 (DCM:hexan). Frakce byly jímány do zkumavek a paralelně byl sledován jejich obsah na tenkovrstvé chromatografii pod UVlampou (obrázek 14).

Obr. 14: Snímek chromatografie vybraných jímaných frakcí během separace pro zjištění, ve kterých frakcích se nachází jednotlivé analyty (nečistoty, cisEHMC, transEHMC). Chromatografie sloužila k výběru frakcí pro analýzu (tím se výrazně snížil počet analyzovaných frakcí na GCFID).

Jednotlivé frakce byly analyzovány pomocí GCFID a byly vybrány nejvhodnější frakce, obsahující co největší podíl isomeru cis. Touto metodou byl získán cisisomer o čistotě více než 98 %.

Získaný roztok v acetonitrilu byl poté odpařen pomocí vakuové odparky na objem cca 3 ml a zbytek acetonitrilu byl následně odfouknut pod inertním plynem N₂. K vyizolovanému vzorku cisEHMC bylo přidáno malé množství DMSO tak, aby koncentrace cisEHMC byla 800 mg.ml¹. Takový vzorek byl poté testován na genotoxický potenciál SOS Chromotestem a UmuC testem a na estrogenní potenciál na buněčných liniích MVLN a HeLa9903.

2.