Masarykova univerzita přírodovědecká fakulta

DMSO a jeho vliv na buněčnou membránu

Dimethylsulfoxid je organosírová sloučenina se vzorcem (CH₃)₂SO. Tato bezbarvá kapalina je důležitým aprotickým polárním rozpouštědlem, které rozpouští polární i nepolární sloučeniny a je mísitelné se širokou škálou organických rozpouštědel i s vodou. Velmi snadno proniká skrz kůži, následně se vylučuje na povrch jazyka a způsobuje tam česnekovou chuť.

Při nízké koncentraci DMSO (méně než 10 mol%) dochází k významné laterální expanzi membrány se souběžným poklesem membránové tloušťky. Při použití DMSO o koncentraci v rozmezí 10 až 20 mol% dochází ke vzniku přechodných pórů a defektů v souvislosti s progresivním ztenčením membrány. Další zvýšení koncentrace DMSO vede k desorpci jednotlivých lipidových molekul z povrchu membrány a následuje rozpad dvojvrstvé struktury lipidové membrány. Membránové ztenčení a zejména vznik pórů je důkazem, že DMSO podporuje pronikání molekul, zejména těch s hydrofilní povahou, přes lipidovou membránu (Gurtovenko and Anwar 2007).

V bakteriálních testech toxicity se používá velmi malé množství DMSO (0,5 až 1 % v reakční směsi), aby nedošlo k ovlivnění růstu buněk E. coli během expozice. V původní metodice UmuC testu (Oda et al. 1985) je koncentrace rovna až 4 %. Přitom bylo zjištěno, že vysoké koncentrace DMSO mohou způsobit indukci SOS odpovědi v UmuC testu (Nakamura et al. 1990). V této studii při koncentraci DMSO rovno 5 % bylo dosaženo IF = 2 a při koncentraci DMSO 10 % až IF = 2,5. Michal Škarek ve své diplomové práci studoval pokles růstu bakterie v závislosti na koncentraci DMSO (Škarek 2001). Bylo zjištěno, že již při koncentraci 5 % DMSO dochází k výraznému poklesu nárůstu bakterie a při koncentraci 10 % byla pozorována až 40 % inhibice růstu. Dále byl proveden test na ověření vlivu DMSO na hodnotu indukčního faktoru, kdy bylo zjištěno, že při vyšší koncentraci než 1 % DMSO v reakční směsi může docházet ke zvýšené indukci SOS systému. V těchto koncentracích sice není patrný vliv na růst buněk, nicméně ovlivnění indukce může být znatelné.

2. SOS Chromotest

SOS Chromotest (Quillardet et al. 1982) je kvantitativní krátkodobý screeningový bakteriální test genotoxicity využívající specifické schopnosti buněk E. coli reagovat na poškození genetické informace. Při poškození bakteriální DNA je indukován SOSreparační systém. Strukturální gen pro enzym βgalaktosidázu podléhá kontrole genu sfiA (sulA). Tento gen je součástí SOSreparačního systému buňky, který je aktivován v případě poškození genetické informace. Gen sfiA (sulA) podléhá kontrole LexA reperesoru, který je v případě SOS odpovědi inaktivován aktivovaným RecA proteinem a to vede k transkripci lacZ genu.

Standardní provedení testu je vypracováno pro kmen E. coli PQ37, který nese genetické markery rfa a uvrA, které tento kmen činí velmi citlivým ke genotoxinům. Test je založen na citlivém systému pro detekci poškození genetického materiálu, v jehož důsledku se stává aktivní SOS enzymatický komplex a je schopen opravit genetické poškození. Tento efekt se navenek projevuje produkcí enzymu βgalaktosidázy. Některé koncentrace testovaných látek mohou působit toxicky, což snižuje produkci βgalaktosidázy a to by mohlo zkreslovat výsledky genotoxicity. Proto byla zavedena (jako indikátor toxického vlivu) extracelulárně syntetizovaná alkalická fosfatáza a pokles její aktivity signalizuje toxický efekt testovaných látek. Oba enzymy jsou detekovány pomocí přeměny specifických chromogenních substrátů (ONPG, PNPP). Výstupem je poměr produkce těchto dvou enzymů. Přeměna chromogenních substrátů je měřena pomocí spektrofotometru.

Obr. 6: A: lacZ operon (syntéza βgalaktosidázy) má odstraněnou promotorovou část a podléhá tedy společné kontrole s vybraným SOS genem. B: Pro zvýšení citlivosti celého systému byla metodami genetického inženýrství vytvořena excizní deficience – mutace tolC genu. C: Poškození DNA = přepis recA genu, který umožňuje aktivaci specifického RecA proteinu, který štěpí represor LexA a umožňuje přepis jednotlivých SOS genů a tedy spuštění celého SOS reparačního systému (včetně reporterového lacZ). Převzato a upraveno z přednášky Ekotoxikologické biotesty – Testy genotoxicity a mutagenity, (Čupr 2011).

1. Příprava zamražené kultury

Lyofilizovanou bakterii získanou z kitu (SOSChromotest, EBPI, Kanada) otevřeme a rozpustíme ji ve 20 ml LB média, převedeme do erlenmayerovy baňky a inkubujeme ji při 37 °C, 120 r.p.m. 16 – 18 hodin. Následující den změříme optickou hustotu při 600 nm a do inokula přidáme 50% glycerin (rozpuštěn ve sterilní destilované vodě) v poměru 3:1 (inokulum:glycerin). Do vysterilizovaných Ependorf mikrozkumavek o objemu 0,75 ml pipetujeme 0,5 ml připraveného inokula v glycerinu. Kulturu ihned zamrazíme ve svislé poloze při 80 °C.

2. Provedení testu

Jako detekční systém v našem provedení SOS Chromotestu je využíván kmen Escherichia coli K12 PQ 37 získaný v podobě lyofilizátu (komerční kit SOSChromotest, EBPI, Kanada). Zásobní bakteriální kultura je uchovávána v zamraženém stavu v glycerinovém médiu.

1. Příprava médií

Tato část obsahuje návod na přípravu médií a roztoků. Sterilizace probíhá po 20 minut při 121 ^oC. Při přípravě je nutné dodržovat základní pravidla sterilní práce.

LB médium

Jedná se o kompletní růstové médium poskytující optimální podmínky pro růst bakterie a přípravu noční kultury. Přídavek ampicilinu umožňuje zajištění selekce funkčních buněk detekčního systému. Médium se připravuje rozpouštěním 1 g tryptonu, 0,5 g yeast extraktu, 1 g NaCl ve 100 ml destilované vody. Po následné sterilizaci média se přidají 2 mg ampicilinu. Uchovává se při 4 ^oC.

Fosfátový pufr

Fosfátový pufr je přidáván do reakční směsi za účelem stabilizace a minimalizace změn pH roztoku po přídavku vzorku optimálního pro růst bakterie. Vychází ze Sorensenova pufračního systému tvořeného dvojicí NaH₂PO₄ a  Na₂HPO₄. Postup přípravy je následující:

0,2 M roztok NaH₂PO₄ připravíme rozpuštěním 1,56 g NaH₂PO₄ . 2 H₂O v 50 ml destilované vody a 0,2 M roztok Na₂HPO₄ připravíme rozpuštěním 7,156 g Na₂HPO₄ . 12 H₂O ve 100 ml destilované vody. Následně roztoky smícháme v poměru 3:22 (0,2 M NaH₂PO₄: 0,2 M Na₂HPO₄) a upravíme pH na 7,4 přídavkem jednoho či druhého z fosforečnanových roztoků. Roztok vysterilizujeme a uchováváme při 4 ^oC.

Bpufr

Bpufr je roztok, který zajišťuje optimální podmínky pro enzymatickou reakci βgalaktosidázy s chromogenním substrátem ONPG. Přítomnost detergentu umožňuje rozbití buněk detekčního systému a tím dochází k uvolnění enzymu z cytosolu. Připravuje se rozpuštěním 4,057 g Na₂HPO₄ . 12 H₂O, 0,622 g NaH₂PO₄ . 2 H₂O, 0,075 g KCl, 0,025 g MgSO₄ . 7 H₂O, 0,1 g SDS ve 100 ml sterilní destilované vody. Po úpravě pH na hodnotu 7,0 uchováváme při teplotě 4 ^oC.

Ppufr

Ppufr je roztok, který zajišťuje optimální podmínky pro enzymatickou reakci alkalické fosfatázy s chromogenním substrátem PNPP a navíc přítomnost detergentu umožňuje rozbití buněk detekčního systému a tím uvolnění enzymu z cytosolu. Připravuje se rozpuštěním 12,1 g tris(hydroxymethyl)aminomethanu a 0,1 g SDS ve 100 ml sterilní destilované vody. Po úpravě pH na hodnotu 7,0 pomocí koncentrované HCl (12 M) uchováváme při teplotě 4 ^oC.

2. Pracovní postup

Inkubace bakteriální kultury

Zamraženou bakteriální kulturu necháme roztát a po šetrném promíchání inokulujeme 200 µl do 20 ml čerstvého LB média. Inkubujeme 16 – 18 hodin při 37 °C, 120 r.p.m. Následující den převedeme 1 ml předinkubované bakterie do 20 ml čerstvého LB média a inkubujeme 2 h, 37 °C, 120 r.p.m. Poté změříme optickou densitu (OD) v 1 cm kyvetě na spektrofotometru při vlnové délce 600 nm. Bakterii naředíme na hustotu s absorbancí A₆₀₀ = 0,04 čerstvým LB médiem a fosfátovým pufrem v poměru 3:1. Výpočet je uveden níže:

 

Kde OD je optická densita naměřená při vlnové délce 600 nm, V je objem inokula, který potřebný pro všechny reakční varianty v testu (je snížený o 1/3, kterou zastupuje fosfátový pufr).

Inkubace bakteriální kultury s testovaným vzorkem

Do jednotlivých Ependorf mikrozkumavek, obsahujících 10 µl vzorku pipetujeme 990 µl inokula. Nezbytnou součástí testu je také negativní kontrola, pozitivní kontrola a blank. Do blanku je namísto reakční směsi přidána směs LB a fosfátového pufru v poměru 3:1. Schéma obsahu jednotlivých variant je uvedeno v tabulce 7.
Tabulka 7: Složení reakčních směsí v negativní kontrole (NK), pozitivní kontrole (PK), blanku a samotném vzorku.

Jako pozitivní kontrola se používá standardní mutagen 4nitroquinoline1oxide (4NQO) o koncentraci c = 0,469 µg.ml¹. Ependorfovy mikrozkumavky vložíme do inkubátoru a inkubujeme 2 h, 37 °C, 120 r.p.m.

Příprava referenčních roztoků

Připravíme ONPG a PNPP roztoky rozpuštěním 20 mg ONPG/PNPP v 10 ml Bpufru/Ppufru. K roztoku ONPG přidáme 27 µl βmerkaptoethanolu. Roztoky rozpipetujeme po 100 μl do jamek dvou mikrodestiček pro stanovení aktivity βgalaktosidázy (s ONPG roztokem) a pro stanovení aktivity alkalické fosfatázy (s PNPP roztokem).

Inkubace v referenčních roztocích

Po inkubaci směsí v Ependorf mikrozkumavkách z nich převedeme 25 µl do jamky s ONPG/PNPP roztokem. Vzorky pipetujeme od nejnižší koncentrace, každou koncentraci ve třech opakováních (do tří jamek). Poté změříme absorbanci jednotlivých mikrodestiček při 420 nm (měření t = 0). Inkubujeme 45 min, 37 °C, 120 r.p.m. Poté znovu změříme absorbanci při 420 nm (měření t = 45).

3. Zpracování výsledků

Odečet hodnot:

Z naměřených hodnot A₄₂₀ v substrátu ONPG i PNPP v čase t = 0 a t = 45 vypočítáme tyto hodnoty:

Kde A₄₂₀RB_t=0 je absorbance jamky s testovanou látkou před inkubací se substrátem, A₄₂₀RB_t=45 je absorbance po 45 minutách inkubace, A₄₂₀NK_t=0 je absorbnace v negativní kontrole před zahájením inkubace, A₄₂₀NK_t=45 je absorbance po 45 minutách inkubace, A₄₂₀BL_t=0 je absorbance spontánně rozloženého substrátu v blanku před zahájením inkubace a A₄₂₀BL_t=45 je absorbance spontánně rozloženého substrátu po ukončení inkubace.

Tyto hodnoty použijeme při výpočtu I a IF.

Výpočet inhibice (I):

Inhibice alkalické fosfatázy (I_i) odrážející inhibici buněk testovanou látkou je zjišťována na základě změny přeměny chromogenního substrátu PNPP ve srovnání s negativní kontrolou. A₄₂₀(RB_i) je změna absorbance vznikajícího pnitrofenolu v jamce i s testovanou látkou po 45 minutách inkubace při 37 °C snížený o změnu absorbance v blanku A₄₂₀(BL). A₄₂₀(NK) je změna absorbance přeměněného substrátu v negativní kontrole snížená opět o změnu v blanku A₄₂₀(BL).

Výsledek lze následně prezentovat v podobě průměrné procentuální inhibice bakterie (v podobě syntézy alkalické fosfatázy) v určité koncentraci testované látky, doplněné o směrodatnou odchylku, ve srovnání s negativní kontrolou rovné 100 %.

V případě, že I < 0,5, tedy jeli bakteriální syntéza enzymu inhibována o více než 50 % syntézy v negativní kontrole, nelze tuto koncentraci vzorku použít pro hodnocení její genotoxických účinků.

Výpočet indukčního faktoru (IF):

IF_i je roven součinu převrácené hodnoty I_i a podílů absorbancí přeměněného substrátu ONPG za vzniku onitrofenolu v jamce i s testovanou látkou a negativní kontrole při 420 nm, kde A₄₂₀(RB_i) je změna absorbance v jamce i s testovanou látkou v chromogenním substrátu ONPG po 45 minutách inkubace při 37 °C snížený o změnu absorbance spontánně rozloženého ONPG v blanku A₄₂₀(BL). A₄₂₀(NK) je změna absorbance v negativní kontrole snížená opět o změnu v blanku A₄₂₀(BL).

Výsledný IF následně prezentujeme opět ve vztahu k negativní kontrole, která je rovna IF = 1. Genotoxické působení testovaných látek zvyšuje hodnotu IF. Průměrná hodnota IF pro jednu koncentraci vzorku je doplněna o směrodatnou odchylku (SD).

Za významný genotoxický potenciál vzorku je označena schopnost indukovat IF = 1,5.

Výsledky lze interpretovat pouze v případě, že hodnota indukční faktoru pro standardní mutagen 4-NQO překročila hranici IF = 20.

3. Porovnání citlivosti SOS Chromotestu v mezilaboratorní studii

V této kapitole popisuji výsledky z projektu „Vývoj bio-analytických technik pro posouzení potenciálního dopadu na lidské zdraví recyklovaných vod“, do kterého jsem byla zapojena. Cílem tohoto projektu bylo rozšířit škálu buněčně založených testů pro monitoring kvality vody a udělat tak první kroky směrem k mezinárodní harmonizaci postupů pro posuzování kvality vod.

Vzorky byly odebrány v prosinci 2011 a v lednu 2012 a extrahovány SPE (HLB + kokosové uhlí) a alikvóty byly zaslány do partnerských laboratoří, které se projektu zúčastnily. Vzorky byly odebrány v různých fázích čištění charakterizovaných takto: sekundárně vyčištěná odpadní voda, membránová filtrace, reverzní osmóza, sekundární odpadní voda, ozonizace a filtrace biologicky aktivním uhlím, pitná voda vstup do úpravny (řeka), pitná voda výstup z úpravny, dešťová voda, blank. Vzorky pak byly zakódovány v jiném pořadí písmeny A, B, C, D, E, F, G, H, J, K (I bylo vyřazeno, aby nedocházelo k záměně I a J).

K suchým extraktům byly přidány 2 µl DMSO pro převezení vzorků. V naší laboratoři RECETOX bylo ke vzorkům přidáno ještě 300 µl DMSO (tedy celkem 302 µl DMSO). Byl vypočítán obohacovací faktor SPE dle vzorce:

Ředící faktor byl vypočítán z objemu extraktu přidaného do testu a z celkového objemu reakční směsi v testu:

Finální obohacovací faktor REF byl vypočítán z obohacovacího a ředícího faktoru:

Hodnoty odpovídající jednotlivým vzorkům jsou uvedeny v tabulce 8.

Tabulka 8: Hodnoty obohacovacích faktorů v jednotlivých ředících krocích.


Výsledky testovaných vzorků vody jsou uvedeny v následujících grafech:










Grafy 9 až 18: Závislost indukčního faktoru (IF) na finálním obohacovacím faktoru (REF), jehož výpočet je popsán výše. Červená linka znázorňuje hranici IF = 1,5, od které je příslušná koncentrace vzorku genotoxická. V prvním grafu (vzorek vody č. 1) byly hodnoty odstraněny z důvodu zvýšené cytotoxicity těchto koncentrací. Cytotoxicita nebyla v opakovaných testech SOS Chromotestu potvrzena.

SOS Chromotest vykázal mírný genotoxický potenciál pouze u vzorků 1, 2 a 5. Genotoxicita se potvrdila v opakovaných testech. Každý vzorek byl testován v triplikátu. Jako pozitivní kontrola byl použit standardní mutagen 4NQO (c = 0,469 µg.ml¹), jehož průměrný indukční faktor byl roven 25,18.

V následující tabulce 9 jsou shrnuty odpovědi v jednotlivých testech genotoxicity z laboratoří, které byly zapojeny do okružní mezilaboratorní studie odpadních vod. Výsledky jsou srovnávány pouze s testy genotoxicity UmuC test a Ames test a to pouze bez metabolické aktivace (S9).
Tabulka 9: Pozitivní/negativní (+/) výsledky v testech genotoxicity jednotlivých extraktů. Srovnání SOS Chromotestu s testy UmuC a Ames test bez metabolické aktivace.


Z výsledků je zřejmé, že pozitivní odpovědi SOS Chromotestu se ve většině případů shodovaly s ostatními testy genotoxicity a tato metoda je tedy dostatečně citlivým nástrojem pro zjištění genotoxického potenciálu. Některé testy vykázaly pozitivní odpověď u více vzorků, což může být způsobeno tím, že extrakty vod měly ostatní laboratoře více zakoncentrované, čehož jsme nemohli kvůli limitaci množství vzorku dosáhnout. Podrobný výstup a hodnocení australské mezilaboratorní studie nebyly ještě publikovány, a proto zde nemohly být uvedeny. Předběžně však lze říci, že se výsledky shodovaly.

2.