Masarykova univerzita přírodovědecká fakulta

3.Materiály a metody

Praktická část diplomové práce se skládala z přípravy fotoproduktů ozařováním UV lampou, analýzy vzniklých směsí na HPLCDAD za použití kolony C18 a následně také pomocí metody GCFID, izolace izomeru cisEHMC z ozářené směsi použitím tenkovrstvé kapalinové chromatografie a sloupcové kolonové chromatografie. Další důležitou součástí experimentální části bylo osvojení UmuC testu a uvedení inovované metody do laboratoře RECETOX a následně testování genotoxického potenciálu izolovaného isomeru na bakteriálních modelech UmuC test a SOS Chromotest.

2. Chemická analýza UV filtrů

UV filtry můžeme nacházet zejména ve vodním prostředí, kam se dostávají splachem z pokožky a to nejen ve vodě, ale i v tělech ryb či jiných vodních organismů. Díky penetraci přes kůži můžeme sledovat hladiny těchto látek (i když v malém množství) také v lidském těle: v moči, krvi a mateřském mléce.

Dále je možné tyto látky analyzovat přímo v matricích/směsích, ve kterých se používají. Tedy v krémech, olejích, tělovém mléce či v jiných nosičích, které se v kosmetickém průmyslu používají. Pro stanovení UV filtrů zejména ve vodných roztocích se nejčastěji používá metoda HPLC s kolonou C18, s UV detektorem DAD 305 – 310 nm (Liu and Wu 2011; Vilela et al. 2011). Jako mobilní fáze se používá MeOH/voda, EtOH/voda či MeCN/voda (Chisvert et al. 2001; Kim et al. 2011).

Pro stanovení sunscreenů v kalu se používá metoda GCMS, tato metoda spolu s použitím PLE extrakce byla vyhodnocena jako vhodnější při analýze zejména velmi nízkých hladin salicylátů (včetně EHMC) než použití LCMS, kdy byly detekční limity ve srovnání s metodou GCMS výrazně horší (Negreira et al. 2011).

Stanovení UV filtrů přímo v kosmetických produktech se častěji provádí pomocí GCMS (Ro et al. 1994). Při experimentech provedených v této diplomové práci byla použita metoda GC s plamenovým detektorem. Podrobnosti k metodě jsou uvedeny v kapitole 4.3. Analýza fotoproduktu.

2. Ozařování UVlampou

Ozařování s cílem získání cisisomeru a dalších fotoproduktů, které způsobují snížení účinnosti UV filtru EHMC, bylo provedeno pomocí UV lampy o výkonu 400W.

2. Analýza fotoproduktu

   1. Plynová chromatografie

Pro analýzu EHMC byla použita metoda GC s plamenovým detektorem (GCFID). Byla upřednostněna před HPLC kvůli lepší interpretaci výsledků. Vzorky EHMC totiž obsahovaly látky (nečistoty) s podobným retenčním časem a u kapalinové chromatografie by nebylo možné zcela jednoduše látky od sebe oddělit.

Analýzy byly prováděny na plynovém chromatografu Agilent 7890A s detektorem FID (280 °C). Byla použita kolona Agilent DBSMS o délce 60 m s vnitřním průměrem 0,25 mm se SF o tloušťce 0,25 mm. Teplota inletu byla 250 °C, objem nástřiku 1 μl. Jako nosný plyn bylo použito helium s průtokem kolonou konstantní rychlostí 30,5 cm.s¹, splitovací poměr byl 8:1.

2. Metody separace

   1. Chromatografie na tenké vrstvě

Obr. 3: Snímek řezu napříč hliníkovou fólií s vrstvou silikagelu (elektronový mikroskop 500x). Částice 10  40 μm, tloušťka vrstvy 300  500 μm. Převzato z přednášky Chromatografické metody II., (Šimek 2012).
Tato separační metoda se používá k oddělení látek na základě odlišné afinity jednotlivých složek směsi ke stacionární a mobilní fázi. U tenkovrstvé chromatografie se jako stacionární fáze používá skleněná, plastová či hliníková destička potažená vrstvou silikagelu. Pro naši separaci cisisomeru byla použita hliníková destička s vrstvou silikagelu (TLC Silica gel 90 F₂₅₄, 20 x 20 cm, MERCK, spol. s.r.o.). Snímek řezu hliníkovou destičkou je uveden na obrázku 3.

Jako mobilní fáze (či eluent) se používá rozpouštědlo nebo směs rozpouštědel, které transportuje vzorek v podobě skvrn plochou stacionární fáze.

2. Sloupcová kapalinová chromatografie

Kolonová chromatografie v chemii je metoda, která se používá k čištění jednotlivých chemických sloučenin ze směsí sloučenin. Hlavní výhodou sloupcové chromatografie je relativně nízká cena a dostupnost stacionární fáze použité v procesu.

Klasická preparativní chromatografická kolona je skleněná trubice o průměru od 5 mm do 50 mm a výšce 5 cm až 1 m s výpustním kohoutkem a nějaký druh filtru (nejčastěji smotek vaty) v dolní části. K přípravě sloupce jsou používány dvě metody přípravy: suchá metoda a metoda mokrou cestou.

Při použití suché metody je sloupec naplněn suchou stacionární fází ve formě prášku. Následně se přidá mobilní fáze, která se prolévá kolonou tak dlouho, dokud nedojde k úplnému smočení stacionární fáze.

Při použití mokré cesty se připraví suspenze eluentu se stacionární fází a ta se poté opatrně nalije do kolony. Je nutné dbát o to, aby v suspenzi nevznikaly nežádoucí vzduchové bubliny. K důkladnému promísení a vyhnání vzduchových bublin je vhodné použít ultrazvukovou lázeň. Tato metoda byla použita při kolonové separaci cisEHMC.

Roztok s organickým materiálem se nakape na horní vrstvu SF (silikagelu), která bývá obvykle převrstvena malým množstvím písku, který chrání vrstvu naneseného analytu před rozvířením při přídavku elučního činidla. Eluent pak prochází stacionární fází a rozděluje směs na jednotlivé frakce, které se jímají do jednotlivých zkumavek. Složení eluátu je možné sledovat např. na tenké vrstvě silikagelu (pomocí TLC) pod UV lampou.

2. Použité bakteriální kultury v testech genotoxicity

   1. Escherichia coli

E. coli byla poprvé objevena Theodorem Escherichem, německorakouským pediatrem a bakteriologem v roce 1885. Je to tyčinkovitá gramnegativní fakultativně anaerobní bakterie, která spadá pod čeleď Enterobacteriaceae. Patří mezi nejlépe prostudované mikroorganismy a je modelovým organismem pro genové a klinické studie. Vnější membrána je tvořena lipidovou dvojvrstvou, ve které jsou ukotveny membránové proteiny. Mezi proteiny, které tvoří póry, patří poriny Omp C, Omp F a Pho E. Poriny slouží jako vstupní a výstupní kanály pro buněčné metabolity a pro příjem vitaminů z okolí. Mezi vnější membránou a buněčnou stěnou je periplazmatický prostor, kde se vyskytují například proteiny vážící cukry a aminokyseliny nebo enzymy degradující antibiotika (betalaktamasy). Buněčná stěna E. coli se skládá z tenké vrstvy peptidoglykanu, pod nímž je cytoplazmatická membrána, skládající se především z proteinů (70 %), lipopolysacharidů a fosfolipidů. Odehrává se zde mnoho biochemických pochodů, (dýchací řetězec a syntéza ATP). Její optimální růst je při 37 °C (Madigan and Martinko 2006).

1. Escherichia coli K12

Obr. 4: Bakterie E. coli K12 pozorována pod elektronovým mikroskopem. Převzato z (Holden 2002).
Tento sérotyp byl původně izolován ze stolice pacienta po rekonvalescenci záškrtu v roce 1922 (Bachmann 1972). Vzhledem k tomu, že E. coli K12 chybí virulentní vlastnosti, roste rychle na běžných laboratorních médiích. Proto se ukázala být cenným nástrojem pro mikrobiální fyziologii a genetický výzkum. E. coli K12 je nejprobádanějším zástupcem E. coli vůbec. Důvodem je přítomnost lysogenního bakteriofága lambda v bakterii a také široká vybavenost E. coli K12 množstvím plasmidů, což dává široké možnosti pro využití v genovém inženýrství. E. coli K12 je znázorněna na obrázku 4.

2. Salmonella Typhimurium

Obr. 5: Snímek z elektronového mikroskopu. Převzato z (PLOS 2005).
Salmonella typhimurium (obrázek 5) je patogenní gramnegativní bakterie převážně se vyskytující ve střevě. Její vnější membrána je tvořena převážně z lipopolysacharidů (LPS), která chrání bakterii od okolního prostředí. LPS se skládá z Oantigenu, polysacharidového jádra a lipidu A, který ji spojuje s vnější membránou. Lipid a se skládá ze dvou fosforylovaných glukosaminů, které jsou připojeny na mastné kyseliny. Tyto fosfátové skupiny určují její bakteriální toxicitu. Zvířata nesou enzym, který specificky odstraňuje tyto fosfátové skupiny ve snaze chránit se před těmito patogeny (Tuin et al. 2006). Oantigen je zodpovědný za imunitní odpověď hostitele. S. typhimurium má schopnost podlehnout acetylaci tohoto Oantigenu, který mění svou konformaci, a protilátky pak nejsou schopny tento Oantigen rozpoznat (Slauch et al. 1995).

2.