Doktorski rad

2. 13. Plinska kromatografija

Plinska kromatografija najraširenija je analitička tehnika i važan je dio opreme svih, kako industrijskih tako i znanstvenih laboratorija koji se bave analizom hrane i pića. Nudi brzu kvalitativnu i kvantitativnu analizu kompleksnih smjesa, značajan utjecaj ima na razvoj istraživanja tvari arome prirodnih materijala. Plinska kromatografija (GC) instrumentalna je separacijska tehnika i vjerojatno je najspretnija za separaciju organskih spojeva, smjesa i čistih tvari (Skoog i sur., 1999.). Bazira se na diferencijalnoj sorpciji sastojaka smjese koja se kreće u odnosu na neki kruti ili tekući adsorbens. Mobilna faza kod plinske kromatografije je u plinskom stanju, a stacionarna faza je kruti adsorbens ili tekućina nanesena na kruti nosač, a smještena je u kromatografskoj koloni. Pri ulasku smjese komponenti u kolonu, ona se trenutno razdjeljuje između stacionarne i mobilne faze. Razdvajanje smjese hlapljivih sastojaka odvija se naizmjenično adsorpcijom i desorpcijom lakše hlapivih sastojaka pod djelovanjem plina nositelja koji odnosi komponente kroz kolonu.

Odvajanje komponenata smjese, metodom plinske kromatografije, može se provesti na dva osnovna načina:

diferencijalna adsorpcija na adsorbensu (plinska adsorpcijska kromatografija - GSC) i

diferencijalno otapanje ili razdjeljivanje u odgovarajućoj selektivnoj tekućini nanesenoj na veliku površinu u tankom sloju (plinska tekućinsko-razdjelna kromatografija - GLC).

Poznate su tri kromatografske tehnike odjeljivanja: frontalna, istiskivanje i eluiranje (ispiranje), koje se mogu primijeniti kod oba načina odvajanja komponenata smjese. Eluiranje je glavna tehnika plinske kromatografije zato što se kolona kontinuirano regenerira s inertnim plinom nositeljem. Određena količina ispitivane smjese uvodi se strujom inertnog plina (plin nositelj) u kromatografsku kolonu. Prolaskom kroz kolonu, smjesa se razdjeljuje između nepokretne faze i struje plina nositelja (pokretna faza). Plin nositelj ispire iz kolone pojedine frakcije, pa su sastojci na taj način pomiješani samo s plinom nositeljem te je stoga olakšano kvalitativno i kvantitativno određivanje komponenata (Moslavac, 2003.).

Slika 16 Shematski prikaz plinske kromatografije (Adlard i sur., 2001.)

Plin nositelj
Svi kemijsko inertni plinovi mogu se koristiti kao plin nositelj, međutim najviše se koriste vodik (H₂), dušik (N₂), helij (He) i argon (Ar). Plin mora biti inertan i ne smije reagirati s uzorkom ili punilom u koloni (Moslavac, 2003.). Vrlo je važno da plin nositelj bude suh i pročišćen od nečistoća koje bi mogle dovesti do lošeg funkcioniranja uređaja, povećati razinu smetnji i kontaminaciju detektora, stoga se često posebno instaliraju uređaji za pročišćavanje plina. Helij visoke čistoće se smatra onaj koji sadrži najmanje 99,99% He. Plin nositelj ne smije sadržavati ugljikovodike, međutim može doći do naknadne kontaminacije tijekom ponovnog punjenja u boce. Izbor plina nositelja ovisi o odgovarajućem radu detektora, sigurnosnim mjerama (H₂ je eksplozivan), cijeni (N₂ je najjeftiniji plin) te efikasnosti i brzini (Moslavac, 2003.).
Uređaj za unošenje uzorka (injektor)
Tekući uzorci najčešće se unose kroz silikonsku ili gumenu membranu tj. septum, u zagrijani dio uređaja koji se nalazi na vrhu kromatografske kolone. Takvi uzorci se najčešće unose pomoću injekcijske mikrolitarske štrcaljke. Međutim ovaj način unošenja uzorka ne zadovoljava kvantitativnu analizu plinova. Zato se za precizno doziranje plinova koristi uređaj za unošenje odmjerene količine plinskog uzorka. Plinovite uzorke najbolje je unositi u kolonu pomoću plinskih (dozirnih) ventila. Unošenje čvrstih uzoraka provodi se najčešće nakon otapanja.

Kromatografske kolone
Kromatografsku kolonu čini cijev i nepokretna faza unutar nje, kroz koju prolazi pokretna faza. Pomoću njih se vrši razdvajanje pojedinih komponenata uzorka. Kolone za kromatografiju izrađuju se iz metalnih, staklenih i plastičnih cijevi u koje se stavlja određeni sorbens, a različitog su oblika i dimenzija (Šiftar, 1968.).

Selektivnost kolone ovisi o izboru odgovarajućeg krutog nosača, načinu punjenja kolone, vrsti i količini selektivne tekućine. Za dobro razdvajanje uzorka u GC najvažniji uvjet je dobar izbor selektivne tekućine koja mora biti: selektivna i dobro otapalo za sve sastojke uzorka, nehlapljiva, termički stabilna i kod povišenih temperatura i kemijski inertna prema sastojcima uzorka koji se analizira. Kolone mogu biti preparativne i analitičke. Preparativne kolone imaju promjer od 10 mm i više, a duljina im može biti i do nekoliko metara. Analitičke kolone se dijele na punjene, mikropunjene i kapilarne.

Punjene kolone izrađuju se od staklenih, metalnih (čelik, bakar, aluminij), plastičnih i teflonskih cijevi. U cijevi se stavlja sitnozrnato punilo ili čvrsti nosač na koji se nanosi stacionarna tekuća faza u tankom sloju (0,05 – 1 m). Kao čvrsti nosač koriste se inertne, termostabilne, mehanički čvrste tvari koje se sastoje od malih kuglastih zrnaca jednolične granulacije, koje ne apsorbiraju sastojke uzorka te koje imaju veliku specifičnu površinu po jedinici volumena. Za izradu čvrstih nosača danas se najčešće koriste posebno obrađene prirodne dijatomejske zemlje, specijalni kruti nosači, teflonski prah i staklene kuglice.

Kapilarne se kolone izrađuju od čelika, aluminija, bakra, plastike, stakla te od izvučenog kvarca. Razlikuju se dvije osnovne vrste kapilarnih kolona: kapilarne kolone gdje je unutarnja stijenka cijevi prevučena s tankim slojem stacionarne faze i mikropunjene kolone koje su također kapilarnih dimenzija gdje je unutarnja stijenka prevučena s punilom sitnih čestica kao što je dijatomejska zemlja na koju je nanesena stacionarna faza.

Djelotvornost mikropunjenih kolona manja je od kapilarnih kolona, ali je znatno veća od punjenih kolona (Moslavac, 2003.).
Termostatirani prostor
Za svaku vrstu spojeva postoji optimalna temperatura pri kojoj odabrana kolona najbolje razdvaja. Ta temperatura kolone koja je približno jednaka vrelištu odjeljivane komponente ovisi o vrelištu uzorka i stupnju traženog odjeljivanja kolone. Prihvatljivo vrijeme eluiranja (2 – 30 min.) postiže se pri temperaturi jednakoj prosječnom vrelištu uzorka ili nešto višoj. Povišenjem temperature smanjuje se vrijeme potrebno za analizu, dok je kod nižih temperatura trajanje eluiranja duže te je analiza dugotrajnija (Moslavac, 2003.).
Detektori
Kao detektor u plinskoj kromatografiji može poslužiti svaki uređaj koji na osnovu nekog kemijskog ili fizikalnog svojstva izeluirane komponente registrira njenu prisutnost u plinu nositelju. Uređaj mora pokazati brz odziv na male promjene koncentracije sastojaka za vrijeme njihove eluacije iz kromatografske kolone. Detekcija se može provoditi mjerenjima koja se zasnivaju na toplinskoj vodljivosti, radioaktivnoj i plamenoj ionizaciji, IR i UV spektrometriji, spektrometriji masa, nuklearno-magnetskoj rezonanciji, potenciometrijskoj i volumetrijskoj titraciji itd. Najviše se koriste detektori koji su osjetljivi prema što većem broju sastojaka analiziranog uzorka, koji su brzi i mogu se koristiti u širokom temperaturnom intervalu. Dominantno mjesto među detektorima koji se najčešće primjenjuju su detektor na toplinsku vodljivost i neki tipovi ionizacijskih detektora (Moslavac, 2003.).
Stacionarne faze
Osnovni zahtjev za stacionarne faze je toplinska stabilnost. Izbor stacionarne faze ovisi o vrsti spojeva koji se razdvajaju. Polimerni spojevi najviše ispunjavaju uvjet toplinske stabilnosti među kojima se ističu siloksanski polimeri svojom visokom toplinskom stabilnošću. Polimer koji sadrži CH₃ skupine kao supstituente je nepolaran gotovo kao ugljikovodik. Zamjenom CH₃ skupine polarnim fenilima dolazi do promjene polarnosti dok se uvođenjem cijanopropilnih skupina djelomično zamjenjuju fenilne skupine u silicijevom lancu što dovodi do faze s najvišom polarnočću među siloksanima. To omogućuje odvajanje umjereno polarnih i polarnih analita. Za odvajanje analita H-donora, kao što su alkoholi, koristi se polietilenglikol jer omogućuje interakcije koje se temelje na vodikovim vezama (Moslavac, 2003.).

2.13.1. Spektrofotometrija masa

Spektroskopija označava mjerenje elektromagnetskog zračenja koje neke tvari na određenoj valnoj duljini emitiraju ili adsorbiraju. Spektrometri su uređaji koji daju određene podatke o molekularnoj strukturi. Spektrometar masa sastoji se od: sustava za uvođenje uzorka, ionskog izvora, masenog analizatora i detekcijskog sustava. U uređaju se molekule uzorka bombardiraju sa snopom elektrona što rezultira ionizacijom zbog kidanja kemijskih veza, pri čemu nastaje niz različitih iona i fragmenata karakterističnih za pojedinu molekulu. Nastali se ioni u analizatoru masa razdvajaju djelovanjem magnetskog i električnog polja prema njihovom odnosu mase i naboja, to omogućava mjerenje njihove relativne količine iona. Svaka vrsta iona ima određenu masu i naboj tj. odnos m/e što predstavlja karakterističnu veličinu za tu vrstu iona. Naboj e = 1 predstavlja vrijednost za ve

inu iona te je odnos m/e masa iona. Niz iona se tako analizira da se dobije signal za svaku vrijednost odnosa m/e. Intenzitet dobivenog signala pokazuje relativnu količinu iona koji taj signal daje. Najveći signal (eng. Peak) naziva se osnovni signal čiji se intenzitet označava sa 100, a intenzitet ostalih signala izražava se prema njemu. Spektar masa predstavlja dijagram koji prikazuje relativne intenzitete signala za različite vrijednosti odnosa m/e i karakterističan je za određeni spoj. S obzirom da svaki kemijski spoj daje karakterističan maseni spektar koji služi za njegovu identifikaciju, kod analize smjese s više komponenti svaka od njih će dati svoj spektar, a ukupni spektar smjese biti će rezultat linearnog zbrajanja komponenata (Young i sur., 1996.).

Spektar masa može se primjeniti za dokazivanje identičnosti dvaju spojeva i kao pomoć pri određivanju strukture novog spoja. Struktura nepoznatog spoja može se odrediti preko molekularne težine ili preko molekularne formule (Moslavac, 2003.).

2.13.2. SPME analize
Godine 1993. Zhang i Pawliszyn razvili su novu tehniku pripreme uzoraka poznatu kao mikroekstrakcija na čvrstoj fazi ili tzv. SPME (eng. solid phase microextraction) tehnika. Ova tahnika zamijenila je najčešće korištene analitičke tehnike, ekstrakciju tekuće-tekuće ili ekstrakciju na čvrstoj fazi te se odnedavna koristi za pripremu različitih čvrstih i tekućih uzoraka poput voća, vina, piva, meda i ulja.

SPME se sastoji od dvije odvojene faze, apsorpcije i desorpcije. Čimbenici koji utječu na ekstrakciju su tip uzorka, vrijeme ekstrakcije, ionska jakost, pH uzorka, temperatura ekstrakcije i mućkanje, dok na desorpciju utječu temperatura i vrijeme desorpcije.

HS-SPME je tehnika koja se koristi za analizu širokog spektra hrane, vina i alkoholnih pića budući da je brza, zahtjeva manju manipulaciju uzorcima te je ekonomski prihvatljiva. Isto tako, omogućuje otkrivanje tragova arome koje nisu prepoznatljive konvencionalnom ekstrakcijom tekuće-tekuće.
Karakteristike SPME
Primjenom SPME tehnike kombinira se ekstrakcija i koncentriranje te je omogućen i diraktan prijelaz adsorbiranih sastojaka u injektor plinskog kromatografa, a na taj način se sprječava ulaz kisika i vlage u kolonu plinskog kromatografa. Ovom tehnikom omogućeno je i koncentriranje sastojaka prisutnih u tragovima unutar sloja punila koje ima mali volumen, ali veliki koeficijent raspodjele sastojaka između punila i uzorka za velik broj organskih spojeva.
SPME aparatura
SPME aparatura sastoji se od kućišta unutar kojeg se nalazi igla. Adsorpcija sastojaka odvija se unutar igle na polimernoj stacionarnoj fazi prevučenoj preko silikatne niti dužine 1 cm. Igla štiti punilo tijekom uporabe i čuvanja, posebice prilikom prolaza kroz septum injektora plinskog kromatografa (Slika 17).


Slika 17 SPME aparatura (Gyorgy i Karoly, 2004.)
Eksperimentalni uvjeti SPME uzorkovanja
SPME uzorkovanje je jednofazni proces. Prilikom pripreme uzoraka za SPME tehniku od velike je važnosti održavati određene uvjete, kao što su temperatura adsorpcije i vrijeme adsorpcije konstantnim budući da promjena tih uvjeta može utjecati na udio sastojaka adsorbiranih na punilo i na odgovarajuću reproducibilnost.

Punila
Za SPME tehniku upotrebljavaju se različita punila ovisno o vrsti i debljini stacionarne faze. Najčešća punila su sa slojem polidimetilsiloksana, sa slojem poliakrilata, kao i različite kombinacije PDMS/ Carboxen, PDMS/ DVB, Carbowax/ divinilbenzen i dr. Nepolarna punila s polidimetil-siloksanom (PDMS) vrlo su djelotvorna za molekule male i srednje molekulske težine, neovisno jesu li polarne ili nepolarne te se stoga najčešće upotrebljavaju.

Utjecaj soli
Osjetljivost SPME tehnike značajno se mijenja povećanjem koncentracije soli. Sol može utjecati na četiri različita načina na promatrane aromatične sastojke:

kod većine sastojaka adsorpcija se povećava s povećanjem koncentracije soli (etil-butanoat, benzaldehid, linalool, neral), adsorpcija sastojaka se poveća na početku, a potom kod veće koncentracije soli prestaje (etil-acetat, geranial), na početku se adsorpcija poveća, a onda se povećanjem koncentracije soli smanjuje (etil-kapronat, kapronska kiselina) i adsorpcija se smanjuje povećanjem koncentracije soli (limonen).

Volumen uzorka
Osim što udio sastojaka adsorbiranih na punilo ovisi o početnoj koncentraciji uzorka, ovisi i o volumenu uzorka. Vrlo je važno održavati konstantnim volumen uzorka, volumen tikvice i položaj igle s punilom u nadprostoru tikvice jer se povećanjem volumena uzorka naglo povećava trajanje adsorpcije koje kod većeg volumena uzorka ostaje gotovo konstantno.
Mješanje uzorka i trajanje ekstrakcije
Konstantnim miješanjem vodenih uzoraka postiže se brže uspostavljanje ravnoteže između vodene i plinovite faze, a kod manje hlapivih sastojaka i smanjenjem volumena nadprostora te povišenjem temperature uzorka.

Kra

e vrijeme ekstrakcije i niža temperatura injektora (5 min/ 250 °C) rezultiraju kromatogramom s ve

im i jasno odijeljenim pikovima sastojaka manje molekulske mase npr. acetaldehid. Duže vrijeme ekstrakcije i viša temperatura injektora rezultiraju ve

im brojem pikova terpena.
2.14. Reološka svojstva hrane
Reologija je znanstvena disciplina koja se bavi tečenjem i deformacijom krutih i tekućih materijala (Lovrić, 2003.; Tabilo-Munizaga i sur., 2005.). Pod deformacijom se podrazumijeva promjena oblika i dimenzija nekog tijela pod utjecajem sile, a pod pojmom tečenja kontinuirana promjena deformacije s vremenom.

Poznavanje reoloških svojstava hrane od velikog je značenja, bilo da se radi o postizavanju određenog svojstva hrane, bilo da se radi o vođenju procesa pri proizvodnji hrane.

Reološki podaci potrebni su u proračunima koji uključuju široku primjenu procesne opreme kao što su cjevovodi, pumpe, ekstruderi, miješalice, izmjenjivači topline, homogenizatori, "on-line" viskozimetri i dr. Osim u procesnom inženjerstvu, reologija se koristi i u razvoju novih proizvoda, definiranju parametara kakvoće, korelaciji sa senzorskom ocjenom hrane, itd. (Ozdemir i Sadikoglu, 1998.; Sopade i sur., 2004.).

Tri su fundamentalna svojstva koja opisuju reološko ponašanje materijala: elastičnost, plastičnost i viskoznost (Bourne, 1982.). Biološki materijali rijetko pokazuju samo jedno od ovih ponašanja, budući da se radi o sustavima složenog sastava.

Elastičnost i plastičnost su osnovna reološka svojstva krutih materijala, a viskoznost tekućih (fluidi). Materijal je idealno elastičan kada se deformacija pojavi trenutačno s djelovanjem sile, a gubi se nakon prestanka njenog djelovanja. Ako materijal podliježe trajnoj deformaciji kada se postigne određeni prag naprezanja, za njega se kaže da pokazuje plastično ponašanje.

Jednostavna klasifikacija reološkog ponašanja materijala (Slika 18) pokazuje Newtonsko ponašanje (idealno viskozan materijal) i Hookeovsko ponašanje (idealno elastičan materijal) kao dvije krajnosti na gornjoj lijevoj i desnoj strani slike. To znači da svi realni sustavi pokazuju i viskozno i elastično ponašanje, iako često dominira jedno od svojstava.

Ne-Newtonske

Newtonske

(vremenski nezavisne)