The mechanism of peptide exchange by mhc II molecules

48 
Chapter II 
Excess biotin was removed by dialysis and successful biotinylation was confirmed with 
native polyacrylamide electrophoresis determining mobility shift with streptavidin.  
 
3.2.2
 
Preparation of HLA-DM used for crystallization 
Soluble  DM  was  produced  using  stably  transfected  CHO  cells  in  hollow  fiber 
bioreactors (Day et al., 2003) and purified by affinity chromatography using protein C 
tag  on  DMα  chain.  Protein  C  tag  as  well  as  Jun  and  HA  tags  on  DMβ  chain  were 
cleaved using 50 units thrombin per 1 mg protein while incubating at 37 ºC for 7 hours. 
To exclude interference with introduced cysteines of the DR molecule, which was later 
mixed  with  DM  for  co-crystallization  experiments,  free  cysteines  on  the  DM  surface 
were alkylated by incubating DM under reducing conditions (1 mM DTT) at 25 ºC for 1 
hour  and  subsequent  dialysis  in  20  mM  Tris  (pH  8),  50  mM  NaCl  containing  10  mM 
iodoacetamide.  Excess  iodoacetamide  was  removed  by  gel  filtration  chromatography 
and DM further purified by ion exchange chromatography.  
 
3.2.3
 
Preparation of covalently linked HLA-DR1/peptide complexes and of HLA-
DR1 mutant 
DR1  molecules with  a low-affinity CLIP peptide (CLIP
low
,  SKARMATGALAQA), 
covalently linked to the DRβ chain, were expressed as a secreted protein in  Sf9 insect 
cells.  After  three  days  the  protein  was  purified  by  affinity  chromatography  with 
monoclonal  antibody  to  DR  (L243;  American  Type  Culture  Collection).  Aggregates 
were  removed  with  a  Superose  6  gel  filtration  column.  The  covalently  linked  CLIP
low
 
peptide and C-terminal leucine zippers were cleaved with V8 protease (endoproteinase 
Glu-C,  New  England  BioLabs  Inc.)  containing  a  His-tag.  The  protease  was  removed 
with  Ni
2+
-NTA  beads  and  protein  was  further  purified  by  ion-exchange  column 
(MonoQ).  Cleaved  CLIP
low
  peptide  was  exchanged  versus  synthesized  HA  peptide 
variants (Peptide2.0 Inc., 21
st
 century biochemicals) containing a cysteine at P6 position 
using redox conditions allowing formation of a disulfide bond between the peptide and 
a  cysteine  introduced  at  position  65  of  DRα  chain  in  the  peptide-binding  groove.  The 
variants of HA peptide were labeled with a DNP group linked to a lysine side chain at 
the peptide C-terminus.  Before protein addition  HA peptides were reduced in 500 µM 
glutathione.  20-fold  molar  excess  of  peptide  was  used  in  50  mM  citrate-phosphate 
buffer (pH 5.3), 150 mM  NaCl  in the presence  of 50 µM of the small molecule J10-1 

---

49 
Chapter II 
and incubated for 2 hours in the presence of 750 µM glutathione. Reactions were then 
shifted  for  2  hours  to  oxidizing  conditions  (950  µM  oxidized  glutathione)  to  promote 
disulfide bond formation. Excess peptide was removed with a Superose 12 gel filtration 
column. As the truncated HA peptide was labeled with a DNP group the complex was 
purified  with  an  α-DNP  affinity  column.  Disulfide  linkage  of  HA  peptides  was 
confirmed on the basis of lower motility of the DRα chain by SDS-PAGE. After a final 
purification  with  a  second  MonoQ  ion  exchange  column  the  purified  complex  was 
concentrated to a final concentration of ~ 10 mg/mL. The yield was ~ 8%.  
The  DR1  mutation  was  introduced  using  the  QuikChange  Lightning  site-directed 
mutagenesis kit (Agilent Technologies) and the DR1 mutant was expressed in Sf9 insect 
cells.  Aggregates  were  removed  by  size  exclusion  chromatography  (Superose  6).  C-
terminal  leucine  zippers  were  removed  by  V8  (endoproteinase  Glu-C,  New  England 
BioLabs  Inc.)  cleavage.  The  peptide  exchange  protocol  was  followed  as  described 
above,  excess  peptide  was  removed  by  size  exclusion  chromatography  (Superose  12) 
and the protein finally purified with α-DNP affinity chromatography.  
 
3.2.4
 
Preparation of HLA-DM with an N-terminally truncated α chain 
DM missing eleven  residues  at  the  N-terminus  of the DMα chain  was  expressed in 
Sf9  insect  cells  and  purified  by  protein  C-affinity  chromatography.  After  removing 
aggregates  with  gel  filtration  (Superose  6)  the  protein  was  further  purified  by  ion 
exchange chromatography (MonoQ) and biotinylated using the protocol as described in 
3.2.1. 
 
3.2.5
 
Surface plasmon resonance experiments  
Surface  plasmon  resonance  (SPR)  experiments  were  conducted  on  a  BIAcore  3000 
machine (GE Healthcare) using streptavidin chips (GE Healthcare), which were primed 
and  normalized  before  immobilization  of  biotinylated  protein.  For  immobilization 
biotinylated  DM  wild-type  (wt)  and  DM  mutant  (αR98A,  αR194A;  mut)  were 
separately  injected  in  two  consecutive  flow  cells  after  diluting  the  protein  to  a 
concentration  of  0.5  mg/mL  in  HBS-EP  buffer  (GE  Healthcare).  500  RU  (response 
units) of protein were immobilized in each flow cell using a flow rate of 10 µL/min at 
25 ºC.  Experiments  were  carried  out  in  degassed  50  mM  citrate  phosphate  buffer  (pH 
5.3),  150  mM  NaCl  and  0.06  %  C
12
E
9
  detergent  (Calbiochem;  EMD  Chemicals). 

---

50 
Chapter II 
DR/peptide  complexes  (analyte)  were  diluted  into  the  running  buffer  before  injection 
and  injected  at  the  appropriate  concentration  followed  by  buffer.  Chips  were 
regenerated  by  injection  of  HA  peptide  (50  µM).  Binding  of  the  reference  flow  cell 
(DM  mut)  was  subtracted  from  binding  in  the  flow  cell  of  DM  wt.  Dissociation 
constants  were  determined  by  curve  fitting  (1:1  Langmuir  model)  using  the 
BIAevaluation  software.  For  experiments  with  DM  possessing  an  N-terminally 
truncated DMα chain, the DM variant was immobilized in flow chamber three; whereas, 
the  DM  mutant  was  immobilized  in  flow  chamber  two  and  DM  wild  type  in  flow 
chamber four. For analysis flow chamber two was subtracted from flow chambers three 
and four, respectively.  
 
3.2.6
 
Protein crystallization, collection of diffraction data and structure solving 
For co-crystallization experiments purified DM and DR1/HA were mixed using a 1:1 
ratio, dialyzed against 10 mM MES buffer (pH 6) and concentrated until a total protein 
concentration  of  ~  10  mg/mL  was  reached.  Initial  screening  plates  were  set  up  at  the 
Collaborative Crystallization Center in Melbourne, Australia, using the nano-dispensing 
crystallization  robots  mosquito  Crystal  (TTP  LabTech)  and  Phoenix  (Rigaku). 
Customized  screens  were  prepared  with  a  Freedom  Evo  liquid  handling  robot  (Tecan 
Group  Ltd.)  preparing  crystallization  conditions  with  a  pH  equal  or  lower  than  6.5. 
Around 480 crystallization conditions  were screened. Final  crystals  of  DR1/HA(P
1,Val
-
P
11
) were grown in 2.5 M ammonium sulfate, 10 % DMSO or 100 mM sodium acetate 
(pH  4.3),  9%  PEG  10,000  at  20 ºC.  Protein  crystallization  was  performed  using 
hanging-drop vapor diffusion. The crystals  were mounted using CryoLoops  (Hampton 
Research)  or  MicroLoops  E  (Mitegen)  and  transferred  into  a  solution  containing  the 
crystallization  condition  and  ~  5  M  xylitol  or  38%  ethylene  glycol  as  cryo-protectant. 
Crystals  were  flash-cooled  in  liquid  nitrogen.  X-ray  diffraction  data  were  collected  at 
beamline 24-ID-E of NE-CAT or beamline 23-ID-D of GM/CA-CAT at the Advanced 
Photon  Source  of  Argonne  National  Laboratory,  IL,  USA.  Crystals  were  stepwise 
exposed  to  X-ray  radiation  by  moving  the  X-ray  beam  along  the  crystal  to  minimize 
radiation damage. Crystals diffracted up to 3.1 Å and 2.14 Å, respectively, and several 
complete data sets were collected from individual crystals.  
Diffraction data were indexed and scaled using the software HKL2000 (Otwinowski 
and Minor, 1997). The structure of DR1 with the truncated HA peptide was solved by 

---