The mechanism of peptide exchange by mhc II molecules

36 
Chapter I 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figure  2.7:  Mass  spectrum  of  purified 
15
N,
13
C,
2
H-labeled  MBP  peptide.  The  spectrum  shows  a 
major peak at ~ 1957 Da which corresponds to deuterated 
15
N,
13
C-labeled MBP peptide. The enlargement 
of  the  peak  shows  a  typical  mass  distribution  of  a  deuterated  sample  with  mass  differences  of  1  Da 
derived from different amounts of deuterium incorporation. 
 
2.3.6
 
Measuring  and  comparing  HSQC  spectra  of  HLA-DR2/
15
N,
13
C,
2
H-MBP 
before and after addition of J10-1 
The deuterated 
15
N-  and 
13
C-labeled MBP peptide was loaded onto  DR2  molecules 
following  the  protocol  described  in  2.2.2.  The  MHCII/peptide  complex  was 
concentrated to a final concentration of ~ 36 mg/mL which nearly doubled the peptide 
concentration  compared  to  the  previous  DR2/
15
N-MBP  complex.  At  first  a  tr-HSQC 
spectrum  without MHC II  loading enhancer was  recorded  which  can be seen in  figure 
2.8  in  red.  The  substantial  improvement  of  the  spectrum  quality  can  be  nicely  seen. 
Many  more  resonances  were  detected  after  increasing  the  sample  concentration  and 
deuterating  the  peptide.  Altogether  18  strong,  four  intermediate  and  at  least  seven 
weaker peaks were detected for the peptide backbone which results in a total of at least 
29  peaks  which  are  more  peaks  than  expected  for  the  15  amino  acid  long  peptide. 
Figure  2.8  also  shows  the  spectrum  of 
15
N-labeled  MBP  peptide  free  in  solution  for 
comparison  (black).  Only  three  peaks  are  potentially  overlapping  indicating  that  the 
15
N,
13
C,
2
H-MBP  peptide  was  not  free  in  solution  but  was  bound  to  DR2  molecule. 

---

37 
Chapter I 
Furthermore, the NMR peaks of the MBP peptide in complex with DR2 show a spread 
over  the 
1
H  axis  indicating  that  the  amide  protons  were  surrounded  by  very  distinct 
chemical environments compared to the amide protons of the free peptide in solution. 
 
 
Figure  2.8:  Overlay  of  tr-HSQC  spectra  of 
15
N-MBP  peptide  free  in  solution  (black)  and 
15
N,
13
C,
2
H-MBP  peptide  in  complex  with  DR2  (red).  The  spectrum  of 
15
N-MBP  peptide  (black)  was 
measured  in  20  mM  citrate  buffer  (pH  5.2)  at  a  concentration  of  0.33  mM  with  a 
1
H  frequency  of  600 
MHz at 30 ºC. The spectrum of 
15
N,
13
C,
2
H-MBP peptide in complex with DR2 (red) was measured in 50 
mM citrate buffer (pH 5.2) at a concentration of 0.6 mM with a 
1
H frequency of 750 MHz at 37 ºC.  
 
After  measuring  the  spectrum  of  triple-labeled  MBP  peptide  in  complex  with  DR2 
one of the most active MHC II loading enhancers, J10-1, was added at a concentration 
of 1 mM and the same tr-HSQC experiment carried out. Figure 2.9 shows an overlay of 
both  tr-HSQC  spectra  with  and  without  MLE.  The  spectrum  in  green  represents  the 
sample after addition of the MLE. As can be seen from the overlay no major chemical 
shifts were observed. However minor changes in  peak intensities were detected  which 
could  be  the  consequence  of  small  molecule  action.  Some  peaks  that  were  just  below 
threshold in the first spectrum appeared in the latter spectrum and other peaks became 
stronger which can be seen in (B) and (C) of figure 2.9 showing parts of both spectra.  

---

38 
Chapter I 
A 
 
B
 
 
 
 
      
C
 
 
Figure 2.9: Overlay and comparison of tr-HSQC spectra of 
15
N,
13
C,
2
H-MBP peptide in complex 
with DR2 before (red) and after (green) MLE addition. Both spectra were measured in 50 mM citrate 
buffer (pH 5.2) at a concentration of 0.6 mM at 37 ºC with a 
1
H frequency of 750 MHz. After measuring 
the  spectrum  of 
15
N,
13
C,
2
H-MBP  peptide  in  complex  with  DR2  alone  (red),  1  mM  of  MHCII  loading 
enhancer  J10-1  was  added  and  the  tr-HSQC  experiment  repeated  (green).  In  (A)  an  overlay  of  both 
spectra can be seen. Peaks with changes in intensity are indicated with blue numbers. (B) and (C) show 
an enlargement of the indicated area in (A). (B) shows part of the spectrum before MLE addition and (C) 
part  of  the  spectrum  after  MLE  addition.  Arrows  are  indicating  significant  intensity  changes  which  are 
observable.  
 

---

39 
Chapter I 
For  quantification  relative  peak  intensities  were  measured  and  compared  (figure 
2.10). Six peaks showed significant changes in peak intensity. Four stronger peaks were 
affected as well as two weaker peaks. Interestingly all six peaks showed an increase in 
intensity after MLE addition.  
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figure  2.10:  Comparison  of  relative  peak  intensities  of  tr-HSQC  spectra  of 
15
N,
13
C,
2
H-MBP 
peptide in complex with DR2 before (blue) and after (red) addition of J10-1. Peaks of the tr-HSQC 
spectra were numbered and relative intensities determined. Blue diamonds indicate peaks of the spectrum 
without  MLE  addition.  Red  squares  represent  peaks  of  the  spectrum  after  MLE  addition.  Significant 
intensity changes are indicated with black circles.  
 
 
2.3.7
 
Performing  HNCA  and 
15
N-NOESY  experiments  of  HLA-DR2/
15
N,
13
C,
2
H-
MBP to determine resonance assignments 
To further investigate which parts of the peptide might have been affected by binding 
of  the  small  molecule  J10-1,  it  was  necessary  to  assign  the  resonances  to  specific 
peptide residues, especially the ones showing a change in intensity. Therefore, using the 
same DR2/
15
N,
13
C,
2
H-MBP sample which was used for measuring the HSQC spectrum 
of the complex, HNCA and 
15
N-NOESY experiments were carried out. By matching C
α
 
chemical shifts obtained from the HNCA experiment and additional spatial information 
from  the 
15
N-NOESY  experiment  some  sequential  assignments  were  made  (see  table 
2.1). But unfortunately the resonance assignments were not unambiguous which can be 
also seen in table 2.1. As there were more peaks than expected for a 15 amino acid long 
peptide  and  apparently  several  distinct  peptide  conformations  present,  it  was  not  clear 
how many peaks actually arose from each peptide residue and which peaks belonged to 
a certain  peptide  conformation.  Only some C
α
  chemical  shifts could  be matched to  C
α
 
chemical  shifts of neighboring peptide residues  and it was not  possible to determine a 
complete C
α
 connectivity. Without knowing the C
α
 connectivity it was also not possible 

---