The mechanism of peptide exchange by mhc II molecules

27 
Chapter I 
and the complex was further purified by  -DNP affinity chromatography. For 
19
F-NMR 
experiments  DR2/MBP  and  cleaved  DR2/CLIP  were  both  concentrated  to  a  final 
concentration  of  1-2  mg/mL  and  buffer  exchanged  against  50  mM  citrate  buffer  (pH 
5.2). 
 
2.2.4
 
NMR experiments 
All  NMR  experiments  with  the  isotope  labeled  MBP  peptide  were  conducted  on 
Bruker  spectrometers  equipped  with  cryogenic  probes  and  were  transverse  relaxation 
optimized  (tr)  (Pervushin  et  al.,  1997).  The  transverse  relaxation-optimized 
1
H-
15
N-
labeled  heteronuclear  single-quantum  coherence  (tr-HSQC)  spectrum  of 
15
N-labeled 
MBP  peptide  was  collected  with  0.33  mM  of  labeled  peptide  in  20  mM  citrate  buffer 
(pH 5.2) and 10% D
2
O at 30 ºC with a 
1
H frequency of 750 MHz and four scans were 
measured. The tr-HSQC spectra of isotope labeled MBP peptide in complex with DR2 
were measured with a protein complex concentration of 0.35 mM or 0.6 mM in either 
10  mM  Tris  (pH  5.2)  and  100  mM  NaCl  or  50  mM  citrate  buffer  (pH  5.2),  both 
including  5%  D
2
O.  The  small  molecule J10-1  was  added  at  a  concentration  of  1  mM. 
The spectra were collected at various 
1
H frequencies (600 MHz, 750 MHz, 900 MHz) at 
33 ºC  or  37  ºC  using  Shigemi  NMR  microtube  assemblies  (Sigma-Aldrich).  For  the 
three-dimensional, 
15
N-selected  NOESY-TROSY-HSQC  experiment  (
15
N-NOESY)  a 
mixing time of 200 ms was used in order to detect long-range nOes (nuclear Overhauser 
effect). 
15
N-NOESY and tr-HNCA experiments were measured with a 
1
H frequency of 
750  MHz.  The  spectra  were  processed  and  analyzed  with  the  programs  NMRPipe 
(Delaglio et al., 1995), CARA (Keller, 2004) and XEASY (Bartels et al., 1995). 
The  one-dimensional 
19
F-NMR  experiments  of  the  small  molecule  J10-11  were 
conducted  on  a  Varian  spectrometer  with  a  magnetic  field  strength  of  11.7  Tesla  at 
25 ºC.  The  concentration  of  the  small  molecule  J10-11  was  250  μM  in  50  mM  citrate 
buffer (pH 5.2) and the  protein complexes DR2/MBP and DR2/CLIP  were  added  at  a 
concentration  of  11  μM.  Micro  NMR  sample  tubes  (New  Era  Enterprises)  were  used 
into  which  a  microcapillary  (New  Era  Enterprises)  was  inserted.  The  sample  was 
pipetted into the microcapillary and 1 mM TFA which was used as a standard with 5% 
D
2
O  was  added  between  the  capillary  and  the  NMR  tube.  Using  microcapillaries 
(volume 50 μL) less sample had to be used. The 
19
F-NMR experiments were processed 
and analyzed using the program MestReNova (Mestrelab Research).  

---

28 
Chapter I 
2.3
 
Results and discussion 
2.3.1
 
Preparing  and  crystallizing  HLA-DR2/MBP  in  the  presence  of  J10 
derivatives 
DR2/MBP  was  used  as  MHC II/peptide  complex  and  crystallization  experiments 
were set  up together  with  one of the two most  active  J10  derivatives,  J10-1 or J10-12 
(see figure 2.1). MBP peptide (residues 85-99) is part of myelin basic protein and has a 
high-affinity  for  DR2  molecules.  Using  fluorescence  polarization  (FP)  assay,  it  had 
been  shown  that  J10  and  its  derivatives  are  active  on  DR2/MBP  and  catalyze  the 
exchange  of  bound  MBP  peptide.  DR2/MBP  was  expressed  in  Sf9  insect  cells  and 
purified  by  affinity  chromatography.  For  some  DR2/MBP  complexes,  the  linker 
between  MBP  peptide  and  DRß  chain  was  proteolytically  cleaved,  but  the  cleaved 
complex  yielded  no  well-diffracting  crystals.  For  co-crystallization,  the  concentrated 
DR2/MBP  complex  was  incubated  with  the  small  molecule  J10-1  or  J10-12  before 
crystallization. Alternatively DR2/MBP crystals were soaked with one of the two small 
molecules.  Various  crystallization  conditions  were  screened  including  crystallization 
conditions of previously crystallized DR molecules. In the end a modified condition of 
the crystallized DR2/MBP complex (Smith et al., 1998) yielded crystals. Crystals from 
co-crystallization  and  soaking  experiments  were  examined  with  X-ray  radiation  and 
some crystals diffracted up to 2.9 Å. DR2/MBP crystallized in a hexagonal lattice and 
the structure was determined with molecular replacement (table 2.1).  
After  structure  refinement  the  electron  density  was  searched  for  extra  density  not 
accounted for by the protein into which the small molecule was manually fitted. A data 
set  from  a  co-crystallization  trial  showed  larger  extra  electron  density  close  to  the  N-
terminus  of  the  peptide  in  the  vicinity  of  residue  Ser53  of  the  DRα  chain.  When  the 
small  molecule  J10-12  was  modeled  into  this  electron  density  a  small  drop  in  R
free
 
factor (Brunger, 1992) was observed after refinement. But after calculating an electron 
density map by omitting the small molecule and part of the DRα chain (Trp α43 to Ser 
α53) only vague and noncontinuous additional electron density appeared in this region 
which could be also explained by several water molecules and was not large enough to 
accommodate  the  small  molecule.  Therefore,  the  small  molecule  could  not 
unambiguously be built into the electron density.  

---