The mechanism of peptide exchange by mhc II molecules

16 
Introduction 
1.7
 
HLA-DO: a negative regulator of HLA-DM 
There are at least three factors that determine peptide editing activity of DM, which 
in turn influences the peptide repertoire presented on MHC II positive cells: the overall 
expression levels of DM, the extent of co-localization of DM with MHC II molecules in 
endosomic  compartments,  and  the  expression  of  another  non-classical  MHC  II 
molecule,  HLA-DO  (DO,  H-2O  in  mice),  which  seems  to  play  an  important  role  in 
modulating DM activity (Leddon and Sant, 2010).  
DO  is  expressed  in  B  cells,  thymic  epithelial  cells  and  certain  subsets  of  dendritic 
cells  (Hornell  et  al.,  2006)  and  its  expression  level  is  further  regulated  by  cell 
maturation.  The  gene  products  of  DO  are  structurally  similar  to  classical  MHC  II 
molecules  and  even  display  more  similarity  to  MHC  II  molecules  than  does  DM  with 
approximately 60% similarity compared to approximately 28% (Cho et al., 1991; Kelly 
et al., 1991; Servenius et al., 1987; Tonnelle et al., 1985; Trowsdale and Kelly, 1985). 
Similar to DM, DO genes show limited polymorphism (Inoko et al., 1985; Jonsson and 
Rask, 1989; Naruse et al., 1999; Naruse et al., 2002; Servenius et al., 1987; van Lith et 
al., 2002). But the expression pattern of DO is different from that of DM and classical 
MHC  II  molecules  which  are  controlled  by  the  class  II  transactivator  (CIITA)  and 
upregulated  by  the  cytokine  interferon-γ.  Whereas  the  DOα  chain  transcription  is 
dependent  on  CIITA,  the  DOß  chain  seems  to  be  subject  of  tight  and  differential 
regulation independent of CIITA even though CIITA expression can still increase DOß 
chain expression (Nagarajan et al., 2002).  
It  has  been  shown  that  DO  requires  DM  association  to  efficiently  exit  the  ER  and 
associates with DM during and after transport to the endocomal/lysosomal compartment 
(Liljedahl  et  al.,  1996). Mutagenesis  studies  mapped  the  DM  binding  site  on  the  DOα 
chain  (Deshaies  et  al.,  2005).  Ex  vivo  experiments  with  human  T  cells  (Denzin  et  al., 
1997)  and  melanoma  cell  lines  (van  Ham  et  al.,  1997)  revealed  an  inhibitory  role  for 
DO illustrated by increased levels of MHC class II/CLIP complexes on the cell surface 
of transfectants expressing DO. In vitro experiments with purified DO and DM showed 
decreased  DM  activity  during  class  II  peptide  loading  reactions  (Denzin  et  al.,  1997; 
Liljedahl  et  al.,  1998;  van  Ham  et  al.,  1997).  Further  studies  have  suggested  that  DO 
inhibition of DM-catalyzed peptide exchange is dependent on pH with lower inhibitory 
function  at  pH  lower  than  pH  5.0  (Kropshofer  et  al.,  1998;  Liljedahl  et  al.,  1996;  van 

---

17 
Introduction 
Ham  et  al.,  2000),  indicating  that  DO  may  preferentially  inhibit  DM  activity  in  early 
endocytic compartments.  
Studies in human B cell lines and primary B cells showed that DO binds to 50-70% 
of the available DM (Chen et al., 2002; Kropshofer et al., 1998). Association of DO and 
DM seems to prevent binding of MHC II molecules. Therefore, a large pool of DM may 
not  be  available  for  peptide  editing  of  MHC  II  molecules  in  human  B  cells.  An 
attractive  model  proposes  that  MHC  II  molecules  and  DO  may  compete  for  the  same 
DM  binding  site  resulting  in  DO  indirectly  influencing  peptide  loading  of  MHC  II 
molecules.  
 
1.8
 
MHC loading enhancers 
Several  groups  of  small  molecules  have  been  identified  which,  like  DM,  catalyze 
peptide  exchange  of  MHC  II  molecules.  These  are  referred  to  as  MHC  loading 
enhancers  (MLE).  Surprisingly,  these  small  molecules  with  molecular  weights  of  less 
than  500  Da  accomplish  a  similar  function  as  the  large  protein  DM  with  a  molecular 
weight of ~ 60 kDa. Changing the peptide repertoire presented towards CD4+ T cells is 
of  great  therapeutic  interest  and  therefore  much  effort  is  put  into  finding  a  small 
molecule that modulates peptide presentation through the MHC  II pathway. As can be 
seen  in  table  1.1,  MLE  exhibit  various  chemical  properties  and  likely  act  by  different 
mechanisms.  
 
alcohols 
The approach of Strominger and colleagues was to  identify a small molecule which 
could  interrupt  the  hydrogen  bond  network  formed  between  peptide  and  MHC  II 
molecules  and  thereby  facilitate  peptide  exchange.  At  first,  simple  alcohols  such  as 
ethanol, propanol and butanol were found to exchange CLIP peptide on DR1 and DR2 
molecules (Falk  et  al.,  2002).  Introducing aromatic alcohols  increased activity  (Marin-
Esteban  et  al.,  2003,  2004),  but  high  concentrations  (10
-4
  –  1  M)  are  still  required  for 
activity.  
 
 
 

---

18 
Introduction 
di-peptides 
Instead  of  altering  the  strength  of  hydrogen  bonds  between  peptide  and  MHC  II 
molecules, the strategy of Falk, Roetzschke and colleagues was to target the P1 pocket 
of DR1 which anchors the N-terminal part of the peptide. The di-peptide Tyr-Arg was 
found to accelerate peptide exchange in DR1 molecules (Gupta et al., 2008). Assuming 
the  tyrosine  binds  in  the  P1  pocket,  the  N-  and  C-termini  of  the  di-peptide  were 
chemically modified with the intent to optimize putative hydrogen bonds which resulted 
in  increased  activity  with  effective  concentrations  of  10
-4
  to  10
-3
  M.  Furthermore, 
mutations  in  the  P1  pocket  affected  the  activity  of  the  di-peptides,  supporting  the 
hypothesis that the di-peptide targeted the area of the P1 pocket.  
 
adamantyl compounds 
The adamantyl compounds were found by Roetzschke, Falk and colleagues using an 
ELISA-based  assay  immobilizing  DR1  molecules  and  measuring  peptide  loading  by 
detection  of  biotinylated  HA  peptide  (Hopner  et  al.,  2006).  Enhanced  peptide  loading 
was observed in the absence of DM and most of the activity could be attributed to the 
adamantane  group.  Similar  to  the  di-peptides  described  above,  the  adamantyl 
compounds are selective for MHC II alleles with a large P1 pocket versus a smaller P1 
pocket,  indicating  that  the  adamantly  compounds  may  act  by  binding  directly  to  that 
site.  
 
inorganic metal complexes  
Another  group  of  MLE  was  found  by  a  high-throughput  approach,  screening  for 
small  molecules  that  remove  peptides  from  MHC  II  molecules.  Two  metal  complexes 
were  found,  cis-platin  and  carboplatin,  which  are  typically  used  as  chemotherapy 
agents, and also related metal complexes with palladium and gold showed activity  (De 
Wall  et  al.,  2006).  The  different  metal  complexes  have  a  square-planar  configuration 
with  the metal  ion  acting as  a weak  Lewis acid  which might  suggest  interactions with 
sulphur atoms of cysteines or methionines (De Wall et al., 2006). The most potent metal 
complex, cis-platin, is active in the range of 10
-6
 – 10
-5
 M. 
 
small molecule enhancers of HLA-DM 
In another high-throughput approach around 100,000 compounds of drug-like small 
molecule  libraries  were  screened  by  Wucherpfennig  and  colleagues  (Call  et  al.,  2009; 

---