The mechanism of peptide exchange by mhc II molecules

32 
Chapter I 
likely  due  to  the  circumstance  that  the  free  amine  at  the  N-terminus  is  in  very  rapid 
exchange  with  solvent  and  is  generally  not  observable.  This  effect  also  sometimes 
broadens the signal of the backbone NH group of the second residue such that no strong 
signal is observed for this position either. 
 
 
Figure  2.4:  tr-HSQC  spectrum  of 
15
N-labeled  MBP  peptide  free  in  solution. 
15
N-MBP  peptide 
was dissolved in 20  mM citrate buffer (pH 5.2) at a concentration of 0.33  mM. The tr-HSQC  spectrum 
was collected at a 
1
H frequency of 600 MHz measuring four scans at 30 ºC. The 13 peaks indicated by the 
box show 13 signals from amide protons of the peptide backbone. NH groups of the peptide backbone of 
the  two  N-terminal  peptide  residues  likely  did  not  give  rise  to  signals.  In  the  high  field  region  of  the 
spectrum  weaker  peaks  of  nitrogen-bound  protons  of  peptide  side  chains  (presumably  asparagines  and 
arginine) can be seen.  
 
Next  a  tr-HSQC  spectrum  of 
15
N-labeled  MBP  peptide  in  complex  with  DR2  was 
collected  at  a  concentration  of  0.35  mM  at  33 ºC  with  a 
1
H  frequency  of  600  MHz. 
Figure  2.5  depicts  the  tr-HSQC  spectrum  of  DR2/
15
N-MBP  which  shows  fewer  and 
weaker peaks compared to the tr-HSQC spectrum of 
15
N-MBP peptide free in solution 
(figure  2.4).  Only  three  strong  and  four  weak  peaks  could  be  detected  for  the  peptide 
backbone besides peaks for peptide side chains.  
 

---

33 
Chapter I 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figure 2.5: tr-HSQC spectrum of 
15
N-labeled MBP peptide in complex with DR2 measured with 
a 
1
H  frequency  of  600 MHz.  The  spectrum  of  DR2/
15
N-MBP  was  measured  in  10  mM  Tris  (pH  5.2), 
100  mM  NaCl  at  a  concentration  of  0.35  mM  at  33  ºC.  The 
1
H  frequency  was  600  MHz  and  64  scans 
were measured. Observable peaks generated by backbone amide protons are indicated with arrows. 
 
 
As  the  NMR  signal  is  stronger  if  the  molecule  has  a  fast  tumbling  rate  free  MBP 
peptide gave rise to  very strong resonances. But  when the MBP peptide was  bound to 
the DR2 protein its tumbling rate corresponded to the tumbling rate of the large protein 
(~ 47 kDa) and due to a shorter relaxation time the NMR signal rapidly decayed leading 
to weaker NMR signal and line broadening. 
As  the  strength  of  the  NMR  signal  is  also  dependent  on  the  magnetic  field  it  is 
possible  to  increase  signal  intensity  using  a  stronger  magnetic  field.  Therefore  a  tr-
HSQC  spectrum  of  DR2/
15
N-MBP  complex  was  measured  at  a 
1
H  frequency  of  900 
MHz. In addition the NMR spectrum was measured at a higher temperature and with a 
higher scan number which also increases signal intensity and signal to noise ratio.  
As can be seen in figure 2.6 measuring the NMR signal at a stronger magnetic field 
(21.1 Tesla instead of 14.1 Tesla), increasing the temperature from 33 °C to 37 °C and 
collecting 256 scans instead of 64 scans improved the quality of the HSQC spectrum. 

---

34 
Chapter I 
Thirteen  instead  of  seven  peaks  were  observed  that  were  likely  arising  from  peptide 
backbone, three stronger, six intermediate and four weaker peaks.  
But  as  some  peak  intensities  were  still  low  and  therefore  peak  changes  upon  small 
molecule addition might have been difficult to detect it was decided to further enhance 
the signal by increasing the concentration of the protein complex and by deuterating the 
peptide  besides 
15
N-  and 
13
C-labeling.  The  advantage  and  effects  of  deuterating  the 
peptide will be explained in the next section.  
 
 
Figure 2.6: tr-HSQC spectrum of 
15
N-labeled MBP peptide in complex with DR2 measured with 
a 
1
H frequency of 900 MHz. The spectrum of DR2/
15
N-MBP was measured in 10 mM Tris (pH 5.2) and 
100 mM NaCl at a concentration of 0.35 mM at 37 ºC. The 
1
H frequency  was 900 MHz and 256 scans 
were measured.  

---

35 
Chapter I 
 
2.3.5
 
Deuterating  MBP  peptide  to  improve  signal  intensity  of  the  HSQC 
spectrum of isotope labeled MBP peptide in complex with HLA-DR2 
As  described  in  the  previous  section  the  detected  NMR  signal  resulting  from 
15
N-
labeled MBP peptide in complex with DR2 was very weak. As the peptide was bound to 
a  large  protein  (~  47  kDa)  its  molecular  tumbling  rate  corresponded  to  the  molecular 
tumbling  rate  of  the  higher  molecular  weight  complex  leading  to  signal  loss.  To 
improve  signal  intensity  temperature,  magnetic  field  strength  and  scan  number  were 
increased. But still not all expected resonances from the peptide were detected. Another 
possibility  to  enhance  signal  intensity  arising  from  backbone  amide  protons  is  to 
minimize  spin-spin  interactions  with  neighboring  protons  by  substituting  non-
exchangeable protons with deuteriums.  
As  the  MBP  peptide  binds  to  the  DR2  molecule  in  an  extended  conformation  the 
backbone  amide  protons  are  in  close  proximity  to  protons  of  the  C
ß
-atom  of  the 
neighboring  residue  causing  fast  relaxation  and  decrease  in  signal  strength.  The  same 
applies  to  the  C
α
-proton  of  the  same  residue  which  is  next  to  the  amide  proton  of  the 
peptide backbone. This effect of fast relaxation can be eliminated by replacing the non-
exchangeable protons of the C
α
- and C
ß
-atoms with deuteriums.  
Another  factor  for  signal  loss  is  the  close  contact  of  the  MBP  peptide  with  DR2 
residues. Again  through  spin-spin  interactions of  the resonating protons of the peptide 
with  resonating  protons  of  the  MHCII  molecule  the  signal  of  the  peptide  is  further 
depleted.  But  as  the  DR2  protein  is  expressed  in  CHO  cells  which  is  a  complex 
expression system a new protocol in a different expression system would have had to be 
established. Therefore only the peptide was deuterated. Furthermore, the MBP peptide 
was 
13
C-labeled to allow triple resonance experiments determining C
α
-connectivity.  
As bacterial growth in D
2
O is very slow compared to H
2
O the bacterial culture was 
gradually adjusted to media prepared with D
2
O. For 
15
N- and 
13
C-incorporation 
15
NH
4
Cl 
and 
13
C-glucose  was  added  to  M9  minimal  media.  The  purification  protocol  was  the 
same  as  for 
15
N-labeled  MBP  peptide  (figure  2.2).  3  mg  of 
15
N,
13
C,
2
H-MBP  peptide 
were  prepared  and  the  yield  was  2.5  mg  of  triple-labeled  MBP  peptide  per  1  liter 
bacterial culture. Successful triple-labeling of the MBP peptide was confirmed by mass 
spectroscopy (see figure 2.7).  
 

---