Laboratuvari

14-Chromogen Dilution Buffer Hydrogen Peroxide/Citrate-Phosphate Buffered Saline  

15-Washing Buffer (5x) Concentrated Phosphate Buffered Saline  

16-Stop Solution 1M Phosphoric Acid  

17-Standards 1-6 0.5, 2.0, 8.0, 20.0, 80.0, 200.0 ng/mL 8-OHdG (1 vial Each) 1 mL each 

18-Plate Seal Adhesive sheet for covering plate 

 

METHODS 

Each sample had three replicates. 

1.

 

Firstly primary antibody with the primary antibody dilution buffer was reconstituted.   

2.

 

Then 50 ul of sample was added to each well. After that 50 ul of reconstituted primary antibody 

was added to all wells expect blank.  

3.

 

Plate was covered with a kind of cover and plate was shaked to mix fully and it was incubated 

for 1 h at 37 C. 

4.

 

At the end of incubation time, contents in plate was poured off. Then 250 ul diluted washing 

buffer  was  added  to  each  well.  It  was  washed  thoroughly  by  agitation.  After  that  plate  was 

inverted and blot against clean paper towel to remove any remaining washing buffer. This step 

was repeated twice. 

5.

 

Secondary  antibody  with  secondary  antibody  dilution  buffer  was  reconstituted.  100  ul  of 

reconstituted secondary antibody was added to each well.  

6.

 

Plate was covered with  cover and after that plate was shaked from side to side to mix fully. 

After shaking, it was incubated at 37C for 1 hour.  

7.

 

Chromogen was diluted and 100 ul diluted chromagen added to each well. After chromogen 

addition, plate was mixed and incubated at room temperature for 15 minutes.  

8.

 

At last 100 ul stop solution was added and after 3 minutes, its absorbance was read at 450 nm.  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

---

4-RESULTS 

 

 

 

  

Absorbance  

Concentration 

(ng/ml) 

Blank 

1,271 

  

Sample 1 

1,217 

0,5 

Sample 2 

1,066 

2 

Sample 3 

0,882 

8 

Sample 4 

0,869 

20 

Sample 5 

0,404 

80 

Sample 6  

0,348 

200 

Equation 

y=-0,151ln(x) + 1,1701 

R2 

0,938 

Figure 4: Absorbance vs Log Scale of Concentration 

 

 

Figure 5: Absorbance vs Log Scale of Concentration 

 

 

 

 

1,217

1,066

0,882 0,869

0,404

0,348

y = -0,151ln(x) + 1,1701

R² = 0,938

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

0,1

1

10

100

1000

---

  

Absorbance  Absorbance-

1,1701=a 

b=a/(-0,151) 

Conc.(ng/ml) 

Unknown1  0,85 

-0,3201 

2,11986755 

8,330034 

Unknown2  0,7 

-0,4701 

3,113245033 

22,49392 

Unknown3  1,207 

0,0369 

-0,244370861 

0,783197 

Figure 6: Absorbance and Standart Deviation Calculations 

1-For unknown 1 y=-0,151ln(x) + 1,1701 

(0,85-1,1701)/(-0,151)=2,12 

ln(x)=2,12    Concentration of Unknown 1: x= 8.33 ng/ml 

2-For unknown 2 y=-0,151ln(x) + 1,1701 

(0,7-1,1701)/(-0,151)=3,11 

ln(x)=3,11    Concentration of Unknown 2: x= 22,49 ng/ml 

3-For unknown 3 y=-0,151ln(x) + 1,1701 

(1,207-1,1701)/(-0,151)=-0,24 

ln(x)=-0,24    Concentration of Unknown 3: x= 0,78 ng/ml 

  

5-DISCUSSION:  

 

When we look the graph and after seeing the R2 value, it can be said that our data fits 

the curve and the R2 is  0,938. This value should be more closer to 1 but even 0,938 can be 

accepted as good one. In this experiment because of fluctuations between reading, the median 

values were taken while drawind the graph. Also while drawing the graph, x axis was taken in 

log scale and the logaritmic trendline was added to our graph. Thus we got an formula which 

contains logarithm function. Our experiment proved that higher concentrations of 8-OhdG in 

the sample solution lead to a reduced binding of the antibody to the 8-OhdG on the plate. When 

the concentration of standard increased, the absorbance values decreased. When I calculated 

the  concentration  of  the  unknowns,  then  I  saw  that  there  is  a  huge  difference  between  our 

results. For example the concentrations of unknowns are 8.33, 22.49 and 0.78 ng/ml. And the 

expected/real concentration is the 8 ng/ml. So it can be concluded that there are some reasons 

that cause such a kind of difference. The source or sources of such a kind of difference can be 

because of various things: 



 

Incomplete washing of wells 



 

Contamination 

---