Laboratuvari

 

Figure 1: Interaction between antigen and antibody 

(www.scizmic.net/downloads/vaccinations/3_vaccinedef.pdf) 

 

 

 

 

 

Enzyme-linked  immunosorbent  assay  is  a  type  of  assay  that  depends  on  the  reaction 

between antigen and antibody in vitro. It is possible to detect and quantify antigens or antibodies 

with the aid of this method. This test was firstly used for HIV screening test. Today, this test is 

used to[2] 

 

for measuring antibody level for allergy and vaccines cases 

 

for detecting viruses such as hepatitis and HIV 

 

for detecting hormonal changes such as in pregnancy, 

 

for detecting circulatory inflammatory markers such as cytokines. 

 

 

 

Generally ELISA is consisted of five main steps. In the first step, plate is coated with 

antibody. In the second step, blocking solution is used for blocking all unbound sites. With the 

aid of using blocking solution, we decrease the possibility of seeing false positive results. After 

blocking all unbound sites with blocking solution, antigen is added to wells. Then anti-mouse 

antibody(IgG) which is  conjugated with an enzyme is added to wells. At the end of ELISA, 

with the activity of enzyme, it is possible to see a colored product[3]. 

 

 

---

 

There are three types of ELISA which are Competitive ELISA, Sandwich ELISA and 

Indirect ELISA. In this laboratory section, competitive ELISA was performed. In competitive 

assay,  specific  antibody  is  used  to  coat  the  plate.  Then  test  antigen  and  labelled  antigen  are 

added to wells and these compete for binding to antibodies. If the amount of the test antigen is 

greater  than  labelled  antigen,  less  amount  of  labelled  antigen  can    bind  to  antibodies.  If  our 

sample  is  consisted  of  more  antigens  then,  less  labeled  antigen  is  remained  in  the  well. 

Therefore weak signal can be detected. The following figure shows us the competitive ELISA. 

The  main  steps  are  the  same  for  all  competitive  ELISA  assays,  only  the  names  of  sample, 

primary and secondary antibodies are different[4]. 

 

Figure 2: Example of Competitive ELISA 

(

www.scizmic.net/downloads/vaccinations/4_vaccinedef.pdf

) 

 

Competitive ELISA has  several  advantages.  It  does  not  require sample processing.  It 

also less sensitive to sample dilutions and sample matrix effects. Therefore with the use of this 

technique,  it  is  possible  to  get  lower  deviation  or  variability  between  repeated  samples  and 

repeated assays. Briefly, it can be said that it has high precision, accuracy and reproducibility. 

The disadvantages of this method according to sandwich assay are  

 

lower sensitivity  

 

lower specificity[5]. 

 

 

 

The main steps of our competitive ELISA: In this experiment, BIOXYTECH 8-OHdG-

EIA Kit was used. This is used for quantitative measurment of 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine 

(8-OHdG)  in  tissue.  In  addition  8-hydroxy-2'-deoxyguanosine  is  one  of  the  important 

---

biomarker for oxidative stress and carcinogenesis. In this kind of ELISA, 8-0HdG is used to 

coat  plate  wells.  And  these  ones  and  the  other  8-0HdG  in  our  sample  compete  for  primary 

antibody  binding  sites.  As  the  concentration  of  8-0HdG  in  sample  increases,  there  will  be 

reduction in the binding of antibodies. After binding antibodies that bound to  8-OhdG in the 

sample are washed out of the well and only the ones that are bound to the plate will remain in 

the plate after this washing step. After that enzyme-labelled secondary antibody is added to well 

and in these well, it will bind to the primary antibody. To remove unbounded ones, washing 

step  is  performed  and  unbounded  secondary  antibodies  are  eliminated  from  the 

sample.Chromogen  is  added  in  to  wells  and  with  the  aid  of  enzyme  that  is  conjugated  to 

secondary antibodies give reaction and turns the color of the solution into yellow. After that to 

stop the reaction stop solution is added and the absorbance values are read with the aid of the 

spectrophotometer. Here is the flow chart of this procedure[6]: 

 

 

Figure 3: The main steps of our competitive ELISA 

(www.scizmic.net/downloads/vaccinations/5_vaccinedef.pdf) 

 

There are also differences in antibodies: Polyclonal and monoclonal. Polyclonal antibodies 

are the ones that: 



 

Their production is not so expensive. 



 

Not so much technology or technique requiring assay, 



 

Its time scale is short. 

---



 

During  production  of  polyclonal  antibodies,  large  amounts  of  nonspecific  antibodies  are 

produced. 



 

These  polyclonal  antibodies  are  able  to  recognizes  multiple  epitopes  that  provides  robust 

detection. 



 

And with the aid of this property, it can give better results in IP/ChIP. 



 

There can be seen variability due to batches. 



 

They belongs to IgG subclass. 

 

Monoclonal antibodies are the ones that 



 

Expensive to produce 



 

It requires more technology and technique. 



 

Its time scale is longer if we consider hybridomas. 



 

It can produce large amounts of specific antibodies but when we compare them polyclonal ones, 

these are so specific. And this kind of specificity decreases the possibility of cross-reaction with 

other proteins. 



 

It can recognize only one epitope of antigen[7]. 

 

3-MATERIALS AND METHODS 

 

MATERIALS  

1-Spectrophotometer 

2-Plate Shaker  

3-Spectrophotometer 

4-Water bath  

5-pNPL 

6-Reagent A 

7-Lipase 

8-OHdG Microtiter Plate-Precoated With 8-OHdG (8×12 wells, Split Type) 

9-Primary Antibody Monoclonal Antibody Specific For 8-OHdG  

10-Primary Antibody Dilution Buffer Phosphate Buffered Saline  

11-Secondary Antibody HRP-Conjugated Antibody  

12-Secondary Antibody Dilution Buffer Phosphate Buffered Saline 

13-Chromogen 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine  

---