Stanovení na ise modulech



Yüklə 445 b.
tarix02.03.2018
ölçüsü445 b.
#28710


Stanovení na ISE modulech

  • Stanovení na ISE modulech

  • Společné stanovení

  • Tři ISE elektrody, jedna referenční (argentchloridová elektroda )

  • Měří se rozdíl potenciálu mezi IS elektrodou a referenční elektrodou

  • ISE elektroda měří aktivitu, přepočet na koncentraci pomocí aktivitního koeficientu

  • Nepřímá a přímá potenciometrie


Analýza vzorku značně naředěného (např. 30x) diluentem o vysoké iontové síle

  • Analýza vzorku značně naředěného (např. 30x) diluentem o vysoké iontové síle

  • Generovaný elektrický potenciál porovnáván s potenciálem standardních roztoků – korekce na teplotu nebo elektrické nestability

  • Koncentrace iontů se počítá podle Nerstovy rovnice



Výsledky odpovídají měření plamenovou emisní spektrofotometrií

  • Výsledky odpovídají měření plamenovou emisní spektrofotometrií

  • Chyba způsobená přítomností proteinů a lipidů v plasmě (7%)

  • Naměřené hodnoty se počítají na celkový objem plasmy

  • Např. koncentrace 145 mmol Na+/l bude ve vodné fázi (počítáme-li 93% vodné fáze) ve skutečnosti 156 mmol Na+/l

  • Negativní chyba známa po řadu let

  • S miniaturizací elektrod - přímá metoda - neprosadila se



Jednotlivé ISE elektrody

  • Jednotlivé ISE elektrody

  • Elektrody integrované - integrovaná chipová technologie

  • Na basi tenkovrstvé ionoforové technologie (ionofory umožňují transport iontů přes membránu)

  • Makrocyklické ionofory - molekuly s dutinou, ve které jsou pevně vázané ionty - crown etery



Doporučená rutinní metoda: FAES (s Li spektrálním pufrem), ISE direct, ISE indirect

  • Doporučená rutinní metoda: FAES (s Li spektrálním pufrem), ISE direct, ISE indirect

  • Referenční metoda: ID-MS, FAES,

  • IC (navržená)

  • Hlavní extracelulární kationt – reprezentuje 90 % všech kationtů v plasmě

  • Hraje centrální roli v  distribuci vody

  • Výrazně se podílí na osmotickém tlaku v extracelulární tekutině



  • Referenční rozmezí:

  • S/P 136-145 mmol/l

  • moč dospělí 70-270 mmol/24 hod

  • děti do 1 roku 10-30 mmol/24 hod



Stanovení Na pomocí ISE:

  • Stanovení Na pomocí ISE:

  • skleněná sodíková elektroda

  • nebo crown éterový případně crown malonátový ionofor integrovaný do iontověselektivní plastové membrány (PVC, teflon)

  • Enzymatické stanovení Na (nedoporučuje se):

  • Metoda založena na aktivaci enzymu b-galoktosidasy ionty sodíku

  • Hydrolýza chromogenního substrátu 2 – nitrofenyl - b - D - galaktopyranosidu na galaktosu a 2-nitrofenol

  • Rychlost hydrolýzy se měří kineticky při 420 nm



  • Excitované atomy Na emitují spektra s ostrou čarou při 768 nm

  • Rutinně se již nepoužívá



Doporučená rutinní metoda: FAES (s Li spektrálním pufrem), ISE direct, ISE indirect

  • Doporučená rutinní metoda: FAES (s Li spektrálním pufrem), ISE direct, ISE indirect

  • Referenční metoda: ID-MS, FAES,

  • IC (navržená)

  • Hlavní intracelulární kationt - koncentrace v erytrocytech je 23x vyšší než v plasmě

  • Vysoká koncentrace uvnitř buňek zajištěna pomalou difuzí přes buněčnou membránu ven

  • Na+,K+ - ATPasová pumpa transportuje kalium do buněk proti koncentračnímu gradientu

  • Interference: Hemolýza zvyšuje hodnoty draslíku



  • Referenční rozmezí:

  • S/P 3,5-5,1 mmol/l

  • moč dospělí 25-125 mmol/24 hod

  • děti do 1 roku 15- 40 mmol/24 hod



Stanovení K pomocí ISE:

  • Stanovení K pomocí ISE:

  • PVC membrána, v ní zabudován valinomycin (na principu iontové výměny)

  • Stanovení K plamenovou emisní spektrofotometrií:

  • Excitované atomy K emitují spektra s ostrou čarou při 589 nm

  • Rutinně se nepoužívá

  • Enzymatické stanovení K:

  • Metoda založena na aktivaci vhodného enzymu ionty draslíku

  • Např. tryptofanasa se substrátem tryptofanem

  • Metoda není doporučena



Doporučená rutinní metoda: Coulometrie, ISE direct, ISE indirect

  • Doporučená rutinní metoda: Coulometrie, ISE direct, ISE indirect

  • Referenční metoda: Coulometrie

  • Hlavní extracelulární aniont - největší frakce anorganických aniontů v plasmě

  • Zásadní role v normální distribuci vody

  • Výrazný podíl na osmotickém tlaku v extracelulární tekutině



Referenční rozmezí:

  • Referenční rozmezí:

  • S/P 98-109 mmol/l

  • moč dospělí 110-250 mmol/24 hod

  • děti do 1 roku 3-10 mmol/24 hod



Stanovení Cl pomocí ISE:

  • Stanovení Cl pomocí ISE:

  • Polymerní membrána – v ní kvarterní amoniové soli

  • Např. trioktylpropylamonium chlorid dekanol

  • Membrána zajišťuje iontovou výměnu solí z membrány s chloridovými ionty

  • Některé firmy používají chloridovou elektrodu v pevné fázi (AgCl)

  • Coulometrie:

  • Stanovení chloridů založeno na generaci Ag+ ze stříbrné anody konstantní rychlostí (konst. proud)

  • Ionty stříbra reagují s chloridy  chlorid stříbrný

  • V bodě ekvivalence se generace stříbrných iontů zastaví

  • Obsah chloridů přímo úměrný času

  • Rutinně se nepoužívá



  • 2Cl- + Hg(SCN)2 HgCl2 + 2 SCN-

  • 3SCN- + Fe3+  Fe (SCN)3

  • červený thiokyanatan železitý se fotometruje

  • v současnosti se nedoporučuje



  • Stanovení v plné krvi

  • Provádí se na přístrojích na měření ABR pomocí ISE elektrod na Na, K a Cl v heparizovaných stříkačkách nebo kapilárách



Doporučená rutinní metoda:

  • Doporučená rutinní metoda:

  • FAAS, FAES, ISE direct, ISE indirect, fotometricky s o-kresolftalexonem, s arsenazo III

  • Referenční metoda: ID-MS, FAAS,

  • IC (navržená)



Referenční rozmezí:

  • Referenční rozmezí:

  • Vápník celkový

  • S/P 2,15-2,55 mmol/l

  • moč M 2,4-7,5 mmol/24 hod

  • Ž 2,4-6,2 mmol/24 hod

  • Vápník ionizovaný

  • krev 1,12-1,32 mmol/l



Tři formy

  • Tři formy

  • ½ vázána na bílkoviny (80% na albumin, zbytek na globuliny)

  • 6% - ve formě komplexních sloučenin ( citrát, laktát, hydrogenuhličitan, fosfát).

  • necelá 1/2 vápník ionizovaný ( volný)

  • Fyziologicky aktivní pouze ionizovaný vápník

  • Jeho koncentraci reguloují hormony PTH a 1,25-dihydroxyvitamin D.

  • Stanovení ionizovaného kalcia se masově neprovádí



Fotometrické metody:

  • Fotometrické metody:

  • Stanovení s o-kresolftaleinkomplexonem:

  • Při pH 12 reagují vápenaté ionty s o-kresolftaleinkomplexonem

  • Vznik stabilního purpurového komplexu s abs. max. 600 nm

  • Magnesium maskováno s 8- hydroxychinolinem

  • Metoda citlivá na vzdušný CO2 - komínky



Fotometrické metody:

  • Fotometrické metody:

  • Stanovení s arsenazo III:

  • Imidazolový pufr, pH 6

  • vápenaté ionty + arzenazo III  modrý komplex

  • činidlo má specifickou afinitu k vápníku (pH 6)

  • Stanovení s NM-BAPTA:

  • Vápenaté ionty + 5-nitro-5’-metyl-BAPTA (pH10)

  • komplex Ca-NM-BAPTA – ten reaguje s EDTA (pH7,3) komplex Ca-EDTA

  • Úbytek absorbance při 600 nm je úměrný koncentraci vápníku

  • Nová vysoce stabilní metoda Roche



Stanovení pomocí AAS:

  • Stanovení pomocí AAS:

  • Naředění (1:50) roztokem chloridu lantanitého nebo strontnatého v kyselém prostředí

  • Plamen acetylén-vzduch, Ca-lampa

  • Naředění podpoří disociaci  uvolnění z fosfátů, snížení viskozity

  • Stanovení se běžně neprovádí



Pomocí ISE na speciálním přístroji nebo přístroji na ABR

  • Pomocí ISE na speciálním přístroji nebo přístroji na ABR

  • Měří se rozdíl potenciálu mezi Ca ISE, resp. pH elektrodou a referenční elektrodou

  • Vydává se i výsledek přepočítaný na pH 7,4

  • ISE elektroda měří aktivitu – ta je přepočítávána na koncentraci pomocí aktivitního koeficientu

  • Kalibrátory musí mít stejnou iontovou sílu (koncentrace sodných a chloridových iontů)

  • Stanovení se provádí z plné krve odebrané do heparinizovaných stříkaček či kapilár



  • Fotometrické stanovení ze sbírané moče

  • Specifičtější stanovení pomocí AAS

  • Vzorek předem okyselit s HCl, rozpustit potenciální krystaly solí

  • U pacientů se sklonem ke zvýšené tvorbě krystalů (pro stanovení souboru litiázy) okyselit celý objem sbírané moče

  • AAS v některých laboratořích v moči rutinně



Doporučená rutinní metoda: FAAS, enzymová UV metoda, fotometrické metody

  • Doporučená rutinní metoda: FAAS, enzymová UV metoda, fotometrické metody

  • Referenční metoda: FAAS, IC (navržená)

  • Stanovení v séru nebo v plasmě:

  • V séru nebo plasmě se magnesium vyskytuje ve třech formách. 55% hořečnatých iontů je volných, asi 30% je vázáno na bílkoviny, zejména na albumin a 15% - se vyskytuje ve formě komplexních sloučenin ( citrát, fosfát atd.).



Referenční rozmezí:

  • Referenční rozmezí:

  • hořčík celkový

  • S/P 0,65-1,05 mmol/l

  • moč 3,0-5,0 mmol/24 hod

  • hořčík ionizovaný

  • krev 0,40-0,65 mmol/l



Fotometrické metody:

  • Fotometrické metody:

  • Stanovení s xylidylovou modří (magon):

  • Mg2+ + xylidylová modř v alkalickém prostředí

  • Vznik purpurové diazoniové soli,  abs. max. 600 nm

  • Ca2+ maskovány s EGTA (kyselina etylen glykol – bis(aminoetyl) tertraoctová)

  • Stanovení s Arzenazo:

  • Mg2+ reagují v alkalickém prostředí s chromogenem arzenazo

  • Vznik fialového komplexu,  abs. max. 570 nm

  • Interferenci vápníku zabráněno specifickým komplexotvorným činidlem



Fotometrické metody:

  • Fotometrické metody:

  • Stanovení s Chlorphfosphonazo III

  • Chlorophosphonazo III (CPZ III) reaguje s hořečnatými ionty za vzniku komplexu Mg-CPZ III.

  • Interferenci Ca 2+ zabraňuje EGTA ( ethylen bis(oxyethylennitrilo)tetra-octová

  • kyselina) - inhibuje vazbu vápníku na CPZ III

  • pH 7,5



Stanovení s calmagitem:

  • Stanovení s calmagitem:

  • Fotometrické stanovení se provádí rovněž v alkalickém prostředí při 520 nm. Kalcium může být maskováno s EGTA.

  • Stanovení s AAS:

  • Stanovení ve provádí po naředění séra (1:50) roztokem chloridu lantanitého nebo strontnatého v kyselém prostředí. Tím se uvolní hořečnaté ionty z komplexů s fosfáty a proteiny. Dojde rovněž ke snížení viskozity. Ke stanovení se používá plamen acetylén-vzduch. V laboratořích klinické biochemie se běžně neprovádí.



Volné magnesium - B:

  • Volné magnesium - B:

  • Stanovení s ISE – spec. přístroj nebo přístroj na ABR

  • (Nova Biomedical)

  • Krátká životnost (1 měsíc), nízká frekvence stanovení, finanční náročnost

  • Stanovení se provádí z plné krve odebrané do heparinizovaných stříkaček či kapilár

  • Stanovení Mg v moči:

  • Fotometrické stanovení ze sbírané moče

  • Specifičtější stanovení pomocí AAS

  • Vzorek předem okyselit s HCl, rozpustit potenciální krystaly solí

  • U pacientů se sklonem ke zvýšené tvorbě krystalů (pro stanovení souboru litiázy) okyselit celý objem sbírané moče

  • AAS v některých laboratořích v moči rutinně



Doporučená rutinní metoda: UV molybdátová metoda

  • Doporučená rutinní metoda: UV molybdátová metoda

  • Referenční metoda: neexistuje (navrhovaná ID-MS, IC)

  • Stanovení v séru, plasmě a moči:

  • Poměr H2PO4- : HPO42- je v kyselém prostředí 1:1, při pH 7,4 1:4 a v alkalické oblasti 1:9

  • 10% fosfátů v séru vázáno na protein, 35% tvoří komplexy s natriem, kalciem a magnesiem, zbývajících 55% volných

  • V krvi anorganické i organické fosfáty

  • Stanovuje se fosfor anorganický, organické estery lokalizovány v buněčných elementech



Referenční rozmezí:

  • Referenční rozmezí:

  • S/P dospělí 0,9-1,5 mmol/l

  • děti 1-2 roky 1,5-2,2 mmol/l

  • moč 13,0-42,0 mmol/24 hod



Stanovení P s molybdenanem amonným:

  • Stanovení P s molybdenanem amonným:

  • Prostředí kyseliny sírové

  • Vznik fosfomolybdátového komplexu (NH4)3[PO4(MoO3)12]

  • a) detekce při 340 nm

  • b) nebo následná reakce fosfomolybdátového komplexu s redukčním činidlem (kyselina aminonaftolsulfonová – nízká stabilita)  fosfomolybdenová modř - 650 nm

  • Stanovení P s molybdenanem a vanadičnanem amonným:

  • Kyselé prostředí

  • Vznik žluté kyseliny molybdátovanadátofosforečné

  • Analýza po vysrážení bílkovin ze supernatantu

  • Jinak  nadhodnocení anorganického fosforu (při reakci dochází k hydrolýze organických esterů)

  • Není vhodná k automatizaci



Doporučená rutinní metoda: fotometrie s ferrozinem

  • Doporučená rutinní metoda: fotometrie s ferrozinem

  • Referenční metoda: neexistuje

  • Stanovení v séru nebo plasmě:

  • Fe3+ vázáno na transportní beta1-globulin apotransferin .

  • Měřená koncentrace železa odpovídá Fe3+ vázanému v sérovém transferinu, nezahrnuje železo obsažené v séru jako volný hemoglobin

  • Běžně Fe3+ obsazuje pouze jednu třetinu vazebných míst v transferinu

  • Navázaná část - saturace transferinu



Referenční rozmezí:

  • Referenční rozmezí:

  • S/P M 10,6-28,3 umol/l

  • Ž 6,6-26,0 umol/l



Po uvolnění z transferinu a po redukci na Fe2+ reakcí se skupinou –N= CH-HC=N

  • Po uvolnění z transferinu a po redukci na Fe2+ reakcí se skupinou –N= CH-HC=N

  • Tvorba barevných komplexů

  • Fotometrické stanovení

  •  



Stanovení železa s ferrozinem:

  • Stanovení železa s ferrozinem:

  • Železo se uvolní z komplexu s transferinem přidáním citrátového pufru (pH<2)

  • Fe3+ redukováno kyselinou askorbovou na dvojmocné

  • Fe2+ s ferrozinem modrý komplex, abs. max. 570 nm

  • Stanovení železa s bathofenantrolinem:

  • V minulosti nejčastěji používána

  • Není však vhodná pro automatizaci (deproteinace),

  • pak se trojmocné železo s kyselinou thioglykolovou redukovalo na dvojmocné.

  • S bathofenantrolinem pak dává Fe2+ červený komplex.



Interference:

  • Interference:

  • Při fotometrických stanoveních hemolýza zanedbatelný vliv

  • Větší vliv hemolýza při stanovení pomocí AAS

  • Stanovení v moči:

  • AAS

  • Provádí se zřídka

  • Nízká koncentrace železa v moči – nevhodné fotometrické metody



Celková a volná vazebná kapacita železa:

  • Celková a volná vazebná kapacita železa:

  • Celková vazebná kapacita železa (TIBC) je metoda, která se využívá k výpočtu saturace transferinu:

  • Koncentrace Fe v séru

  • Saturace transferinu (%) = ---------------------------- x 100

  • Konc. TIBC

  • V současnosti minimální použití

  • Výpočet saturace transferinu – provádí se z koncentrace

  • transferinu a železa

  • Koncentrace Fe v séru (umol/l)

  • Saturace transferinu (%) = -------------------------------- x 3,98 x100

  • Konc. Transferinu (g/l)



  • S/P celková vazebná kapacita

  • 45-75 umol/l

  • saturace transferinu železem

  • M 0,21-0,40

  • Ž 0,20-0,36



V minulosti – nelze automatizovat

  • V minulosti – nelze automatizovat

  • Přídavek nadbytku roztoku chloridu želetitého - vysycení transferinu

  • Přidat pevný uhličitan hořečnatý – reaguje s přebytečným Fe

  • Směs se promíchá, po půl hodině odstředí

  • V supernatantu se stanoví koncentrace Fe odpovídající celkové vazebné kapacitě železa



  • Alkal. pufr, přídavek známé konc. Fe2+ v nadbytku.

  • Specifická vazba na transferin

  • Nezreagované Fe2+ stanoveny s ferrozinem

  • Rozdíl mezi koncentrací původně přidáváných Fe2+ a stanovenou koncentrací = volné vazebné kapacitě

  • Celková vazebná kapacita - součet volné vazebné kapacity a sérového železa



  • v organismu ve velmi nízkých koncentracích (μmol/l)

  • dostatečně citlivá metoda

  • v preanalytické fázi zabránit kontaminaci biologického vzorku



ZINEK

    • ZINEK
  • Analyzovaný materiál: S, P, U

  • Stabilita: S 2 týdny (+4 °C), 1r (-20 °C )

  • Speciální preanalytické požadavky: zabránit kontaktu s gumou

  • Referenční rozmezí:

  • S,P 9,5 – 19,0 μmol/l

  • dU 3,0 – 9,0 μmol/24h



MĚĎ

    • MĚĎ
  • Analyzovaný materiál: S, P, U

  • Stabilita: S 2 týdny (+4 °C), 1r (-20 °C )

  • Speciální preanalytické požadavky: obecná pravidla pro stopovou analýzu

  • Referenční rozmezí: S,P M 11,0-22,0 μmol/l

  • Ž 12,5-24,0 μmol/l

  • dU 0,2 – 0,9 μmol/24h



SELEN

    • SELEN
  • Analyzovaný materiál: S, P, B

  • Stabilita: S 2 týdny (+4 °C), 1r (-20 °C )

  • Speciální preanalytické požadavky: obecná pravidla pro stopovou analýzu

  • Referenční rozmezí: S,P 0,8 – 1,2 μmol/l

  • dU 0,1 – 0,4 μmol/24h



Referenční metoda: Neutronová aktivační analýza (NAA)

  • Referenční metoda: Neutronová aktivační analýza (NAA)

  • nedestruktivní

  • Doporučené metody:

  • ATOMOVÁ ABSORPČNÍ SPEKTROMETRIE

  • - PLAMENOVÁ (FAAS)

  • - S ELEKTROTERMICKOU ATOMIZACÍ (ETA-AAS)

  • ATOMOVÁ EMISNÍ SPEKTROMETRIE S INDUKČNĚ VÁZANÝM PLAZMATEM (ICP-AES) a její modifikace



ATOMOVÁ EMISNÍ SPEKTROMETRIE S INDUKČNĚ

  • ATOMOVÁ EMISNÍ SPEKTROMETRIE S INDUKČNĚ

  • VÁZANÝM PLAZMATEM

  • výboj vzniká v proudu argonu – ten protéká plazmovou hlavicí v kruhové indukční cívce kde protéká vysokofrekvenční proud a vzniká elektromagnetické pole

  • teplota 5000° - 10000° K

  • dochází snadno k vypaření aerosolu vzorku, disociaci, atomizaci a excitaci atomů prvků

  • čarovou emisí excitovaných atomů a iontů je tvořeno záření

  • záření je monochromatizováno v mřížkovém spektrálním přístroji a detekováno

  • multiprvková analýza



Yüklə 445 b.

Dostları ilə paylaş:




Verilənlər bazası müəlliflik hüququ ilə müdafiə olunur ©www.genderi.org 2024
rəhbərliyinə müraciət

    Ana səhifə