Kromozomlar



Yüklə 59,91 Kb.
tarix11.04.2018
ölçüsü59,91 Kb.
#37170



KOÜ TIP FAKÜLTESİ




TIBBİ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI

DÖNEM I ÖĞRENCİ LABORATUVARI / 1



Kromozomlar, karyotipleme, CGH ve FISH


KROMOZOMLAR
Her hücrede genom, genomik DNA’nın çeşitli gruplara ait kromozomal proteinlerle birleşmesinden oluşan kromatin halinde paketlenir. Kromatinde bulunan proteinlerin bazıları yapısal rol oynarken diğer bir kısmı gen ekspresyonunu düzenler. Hücre bölünmesi sırasındaki hariç, kromatin hücre çekirdeği içinde dağılmış vaziyettedir ve mikroskop altında oldukça homojen bir görünüme sahiptir. Bununla birlikte, hücre bölünürken çekirdek materyali yoğunlaşır mikroskobik olarak görülen kromozomlar belirir. Kromozomlar sadece bölünme sırasında görülen özel yapılar olmasına rağmen bütünlüklerini bölünmeler esnasında korurlar.



Figür 1: DNA’nın bazik histon proteinleri ile kendi üzerine katlanarak metefaz safhasındaki kromozomlara dönüşmesi.
Her tür kendine özgü sayı ve morfolojiye sahip karakteristik kromozom yapısına (karyotip) sahiptir.


Türler

Diploid Kromozom Sayısı

Homo sapiens (İnsan)

46

Pan troglodytes (Şempanze)

48

Canis familiaris (Köpek)

78

Felis cattus (Kedi)

38

Equus caballus (At)

64

Equus asinus (Eşek)

62

Gallus domesticus (Horoz)

78

Rana pipiens (Kurbağa)

26

Cyprinus carpio (Balık)

104

Drosophila melanogaster (Meyve sineği)

8

Zea mays (Mısır)

20

Pisum sativum (Bezelye)

14

Pinus (Çam)

24

Danaus plexippus (Kelebek)

~380

Cyathea dealbata (Eğrelti otu)

~1200

Ovis canadensis (Koyun)

54


Tablo 1: Farklı türlere ait diploid kromozom sayıları.
Kromozomların yapı ve kalıtımlarının çalışılması sitogenetik olarak adlandırılır. Modern anlamda insan sitogenetiği, Tijo ve Levan tarafından kromozomları analiz edecek etkin tekniklerin geliştirilmesi ve normal insan kromozom sayısının 46 olduğunun ortaya koyduğu 1956 yılında başlar.

Sitogenetik uygulamalar günümüzde başta klinik tanı, gen haritalaması, kanser sitogenetiği ve prenatal tanı gibi pek çok alanda sıklıkla kullanılmaktadır. Bir kromozom raporunu yorumlamak, metodoliji ile ilgili bazı bilgilere sahip olmak, kromozom çalışmaları ve onların sınırları hakkında görüşü olmak bugün bu konu ile ilgili araştırmacıların, hekimlerin ve doğumsal anomalileri olan, mental retarde, cinsel gelişim bozuklukları ayrıca çeşitli kanserli kişilerle çalışanlar için temel beceridir.


Kromozomlar özel bazı bölgelerden oluşmaktadır:
Kromatid- Kromatinlerin protein iskelete sarılması ile ortaya çıkan yapılara denir ve kromozomun kolları gibi görülürler. Sentromerin her iki tarafındaki kromatidler kromozom kolu olarak adlandırılırlar. Sentromerin ikiye ayırdığı kromatidler kromozomun kısa kolu (p kolu) ve uzun kolu (q kolu) olarak adlandırılırlar. Kardeş kromatidler (sister chromatids) birbiriyle tamamen aynı olan genetik bilgiyi taşırlar ( Mayoz I’in krossover’na kadar).

Sentromer- Sentromerler aslında spesifik proteinlerin bağlandığı DNA dizileridir. Bu proteinler arasındaki kinetokor proteinleri, mayoz ve mitoz bölünmelerin anafaz safhaları esnasında kromozomların iğ ipliklerine tutunarak hücrenin kutuplarına doğru hareket etmelerini sağlarlar. Sentromer kromozomu p ve q olarak iki kola ayıran ve sitogenetik bir belirleyici olarak görünen primer konstriksiyon (boğum) olarak tanımlanır.

Telomerler- Telomerler kromozomların uc kısımlarında bulunan özel DNA dizileridir. Kromozom uçlarında hem kendi üzerine katlanmasını hem de diğer kromozomlara yapışmasını engelleyerek kromozomun bütünlüğünde büyük rol oynarlar. Yaşlanma ile birlikte telomerik DNA dizileri kısalmaya başlar. Kanser hücrelerinin telomerik dizilerinde kısalma gözlenmez.

Replikasyon başlangıç noktası (Origins of Replication, ORI)- Işık mikroskobu ile görülememesine rağmen, bütün kromozomlar en az bir tane DNA sentezinin başladığı bölge içerirler. Ökaryotik kromozomlarda birden fazla ORI bölgesi bulunur.


Figür 2: Mitoz esnasındaki bir insan kromozomunun şematik görünümü.
Kromozomlar sentromerlerinin konumlarına göre sınıflandırılırlar
Bölünen insan hücrelerinin kondanse kromozomaları en kolay metafaz veya prometafazda analiz edilir. Bu evrede kromozomlar sentromerlerinden birleşmiş kardeş kromatidlerden oluşur ve mikroskop altında kromozom yaymalarında görünür durumdadırlar. Kromozomların çoğu sadece boyları ile değil, aynı zamanda sentromerlerin kromozm üzerindeki yerleşimi ile de birbirlerinden ayrılırlar. Bir kromozom, sentromerinin pozisyonuna göre submetasentrik, metasentrik, akrosentrik ve telosentrik olarak ayırt edilebilir. Sentromer submetasentrik bir kromozomu kısa kol (p) ve uzun kol (q) olarak böler. Metasentrik kromozomlarda kısa ve uzun kollar yaklaşık aynı uzunluktadır. Akrosentrik kromozomlarda, kısa kol çok küçüktür ve kısa kolun ucunda satellit olarak isimlendirilen (satellit DNA ile karıştırılmamalı) yoğun bir yapı bulunur. Satellit büyüklüğü, bir bireyin her akrosentrik kromozomu için farklıdır (kromozomal polimorfizm). Telosentrik kromozomlarda kısa kol ve satellit bulunmaz. İnsan kromozomları arasında telosentrik kromozom bulunmazken ev faresinin (Mus musculus) tüm kromozomları telosentrik kromozomlardır.


Figür 3: Senromerin yerleşim bölgesine bağlı farklı kromozom tipleri.
Karyotip analizi
Karyotip, bir organizmaya ait kromozomların yapısal ve sayısal özellikleri dikkate alınarak homolog çiftler şeklinde düzenlenmesi demektir. Karyotip her tür için karakteristiktir. Bununla beraber karyotip terimi, bir birey için veya bir tek hücre içinde kullanılabilir.

Eşey hücreleri hariç organizmayı oluşturan tüm hücrelere somatik hücreler adı verilir. İnsan (Homo sapiens) somatik hücrelerindeki 46 kromozom 23 çift halindedir. Bu 23 çiftin 22’si dişi ve erkeklerde benzer olup otozom olarak adlandırılır, otozom kromozomlarına ek olarak dişilerde iki X veya erkeklerde bir X ve bir Y kromozomu bulunmaktadır (46,XX dişi, 46,XY erkek).


İnsandaki sitogenetik isimlendirme sistemi 1978 yılındaki uluslar arası komitenin kararı ile standart hale getirilmiştir (An international system for human cytogenetic nomenclature (1978): ISCN). Buna göre insan karyotip formülünde (örn; 46,XX), virgülden önce mevcut kromozomların total sayısı, virgülden sonra seks kromozomlarının kompozisyonu verilir. İnsanlarda 22 çift otozom kromozom yedi gruba ayrılır (A-G).


İnsan kromozom gruplarının genel karakteristikleri
Grup A:  Kromozom 1–3.  Bunlar insan karyotipinin en büyük kromozomlarıdır. Kromozom 1 en büyük ,3 ise grubun en küçüğüdür bu iki kromozom metasentriktir. Kromozom 2 submetasentriktir.

Grup B: Kromozom 4–5.  A grubundan sonraki sub metasentrik olan diğer iki büyük kromozomdur. Bu gruptaki kromozomların boyutları birbirine çok yakın olmasına rağmen kromozom 4 kromozom 5’de biraz büyüktür.

Grup C: Kromozom 6–12.  Orta büyüklükteki submetasentrik kromozomlardır. Bu grup kromozomları büyüklüklerine bakarak birbirinden ayırmak oldukça güçtür. X kromozomu bu grup kromozomlardandır.

Grup D: Kromozom 13–15.  Orta büyüklükteki akrosentrik kromozomlardır. Büyüklükleri ve şekilleri birbirine çok yakındır ve gözle ayırt edilmeleri zordur. Bu grup kromozomlar incelenirken satellit yapıları görülebilir.

Grup E: Kromozom 16–18. 16. kromozom, küçük metasentriğe yakın ve grubun en kolay ayırtedilir kromozomdur. Kromozom 17 ve 18 submetasentrik kromozomlardır ve birbirlerinden ayırt edilmeleri güçtür.

Grup F: Kromozom 19–20.  En küçük metasentrik kromozomlardır. Normal boyama ile mikroskop altında ayırt edilmesi imkânsızdır.

Grup G: Kromozom 21–22.  En küçük akrosentrik kromozomlardır.  Birbirinden ayırt edilmeleri çok güçtür. Y kromozomu bu gruba dâhildir, 21. ve 22. kromozomdan boyanma şeklinin farklı olması ile ayrılır.





Figür 4: Normal bir erkek cinsiyete(46,XY) ait kromozomların (a) ışık mikroskobu altındaki genel görünümü ve (b) karyotipi.
İnsanda kromozom anomalileri
İnsandaki normal 46 kromozom sayısındaki herhangi bir değişiklik kendini fenotipik olarak gösterecektir. 46 dışındaki herhangi bir kromozom sayısına heteroploid adı verilir. Haploid kromozm sayısının (n) tam katları şekilindeki anomalilere öploid (euploid) ve diğer kromozom sayı farkı anomalilerinede anöploid (aneuploid) adı verilir.

Euploidi
Diploid 46 2n

Triploidi 69 3n

Tetraploidi 92 4n Poliploidi

Pentaploidi 115 5n
Aneuploidi
2n-1 2n+1

2n-2 Hipoploidi 2n+2 Hiperploidi

2n-3 2n+3
Poliploidiler (3n, 4n) zaman zaman fetüslerde görülmüştür, ancak triploid bebekler canlı doğabilseler bile uzun yaşayamazlar. Triploidilerin en sık olarak bir yumurtanın iki spermle birden döllenmesine bağlı olarak görülür. Ayrıca mayoz bölünmelerden birindeki diploid yumurta veya spermle sonuçlanan hatalarda vakaların bir kısmından sorumlu tutulabilir.

Aneuploidi insan kromozom bozuklukları arasında en sık görüleni ve klinik olarak en önemli tipidir. Klinik olarak teşhis edilen tüm gebeliklerin en az %3-4’ünde bulunur. Somatik kromozomların aneuploidisi seks kromozomlarına göre çok daha nadirdir. Seks kromozomlarında meydana gelen aneupoidiler organizma için daha tolere edilebilir bozukluklardır. Aneuploid hastaların tümünde ya trizomi ( belirli bir kromozomun iki yerine üç adet bulunması) veya daha nadiren monozomi ( belirli bir kromozomun tek bir temsilcisinin bulunması) vardır. Trizomi genomun her bir parçasında oluşabilir ancak bir kromozomun tümünün trizomisi yaşamla nadiren bağdaşır. Canlı doğan bebeklerde en sık görülen trizomi tipi, Down sendromlu hastaların %95’inde gözlenen 21. kromozomun trizomisidir (47, XX veya XY,+21). Bir kromozomun tümünün monozomisi ise hemen hemen daima ölümcüldür. Önemli bir istisna Turner sendromlu hastalarda görülür, bu hastalarda X kromozomunun monozomisi görülür (45,XO).





Figür 5: Triploid karyotip örneği (69,XXX).



Figür 6: Turner sendromu karyotip örneği (45,X).



Figür 7: Klinefelter sendromu karyotip örneği (47,XXY).


Figür 8: Down sendromu karyotip örneği (47,XX,+21).



Figür 9: Trizomi 13 (Patau syndrome) karyotip örneği (47,XX,+13).



Figür 10: Trizomi 18 (Edwards syndrome) karyotip örneği (47, XY, +18)



Figür 11: Cri-du-chat sendromu karyotip örneği (46, XX, del(5p-))

Figür:_Turner_sendromu_şüphesi_olan_kromozom_örneği_(46,X,i(Xq))__Figür'>Figür: Turner sendromu şüphesi olan kromozom örneği (46,X,i(Xq))

Figür: 22. kromozomun diğer 22. karomozoma translokasyonu (45,XX,t(22q;22q))

Figür: Kompleks translokasyon (46,XY;der(2)t(2;13)(pter;q13)t(2;18)(?;qter)
FISH (Fluorescent In-Situ Hybridization)
FISH moleküler ve sitogenetik yaklaşımların birleşimi olan moleküler sitogenetik bir analiz yöntemidir. Bu yöntemde, klinik materyaldaki anormal bir kromozomun varlığını hızlıca teşhis etmek veya kromozomların belirli yeniden düzenlenmelerini saptamak amacıyla kromozomlar için, kromozom bölgeleri için veya genler için spesifik DNA probları kullanılır. Gen veya lokusa özgü problar belirli bir genin varlığını, yokluğunu veya lokalizasyonunu saptamak için hem metafaz kromozomlarında, hem de interfaz hücrelerinde kulanılabilir.

Figür 13: FISH mikroskop ve karyotip görüntüsü.
CGH (Comparative genomic hybridization)

CGH moleküler sitogenetik bir metoddur, bu yöntemle kromozomal dengesizlikler tespit edilebilir. CGH’de iki genomik DNA örneği normal bir kişiye ait metefaz kromozomlarına in situ olarak hibridlenir. Farklı florokrom boyalarla boyanarak (DAPI, FITC ve TRITC), referans kromozom üzerindeki iki florosens sinyal arasındaki yoğunluk ölçülür. Bu orana göre; kullanılan DNA örnekleri arasındaki kopya sayısı oranı elde edilir. Bu analizlerin yapılabilmesi için quantitatif dijital floresans görüntü analizi gereklidir.



Karyotip analizinin yapılması
Pek çok insan dokusu kromozom elde etmek ve sitogenetik analiz için kullanılabilir. Dokunun seçimi hasta tipine (prenatal veya postnatal), tanının amacına (doğumsal veya sonradan kazanılmış) ve hastalığın klinik özelliklerine bağlı olarak değişebilir. Prenatal tanılar için özellikle amniyotik hücreler, koryon villi hücreleri veya fetal kan lenfositleri öncelik sırası ile tercih edilir. Bunlara ilaveten, test yapılacak dokunun ve yöntemin seçimi hamilelik süresine, sitogenetik veya biyokimyasal/genetik testlerden hangisinin öncelikle yapılacağına bağlı olarak test materyali değişebilir. İlaç kullanarak hamileliğin sonlandırılması veya abortuslarda eğer gerekli ise fetüse ait plasenta, deri akciğer ve böbreklerden elde edilen dokular test için kullanılabilir. Yeni doğan ve erişkinlerdeki doğumsal rahatsızlıklar için öncelikle tercih edilen test materyali periferik kandır. Bununla birlikte daha az sıklıkla olmak kaydıyla kemik iliği, deri ve diğer uygun dokular klinik belirtilere ve sitogenetik teşhisin amacına göre kullanılabilir. Sıklıkla neoplazmalarla ilişkili olan sonradan kazanılmış kromozom abnormalitelerinde malignansinin olduğu dokular sitogenetik test için kullanılır (kemik iliği, pleural sıvı, spinal sıvı, lenf nodu ve diğer solid tümörler gibi).

Rutin laboratuvarlarda genel olarak karyotip analizinin (kromozom analizi) yapılması; lenfosit kültürünün hazırlanması, hastadan alınan kanın kültüre ekilmesi, harvest ve tripsin ile bantlama aşamalarından oluşur. Özellikle kültürün hazırlanma ve kanın ekim aşamaları steril bir şekilde yapılmalı herhangi bir kontaminasyona karşı dikkatli olunmalıdır.

Laboratuvarda sitogenetik olarak kullanılacak kan muhakkak heparinli enjektör veya tüpe alınmalıdır ve kan dikkatlice karıştırılarak kanın pıhtılaşması önlenmelidir.

Alınan kan iki şekilde kültür edilebilir. İlk kültür yönteminde, alınan kan bekletilerek sedimentasyona terk edilir ve elde edilen lökositçe zengin sıvı, standart teknik ya da makro kültür tekniği denen periferik kan kültürü ortamına konur. Bu yöntemde alınan periferik kan miktarı nispeten fazladır (10 ml kadar). İkinci kültür yöntemi olan mikrokültür veya tüm kan kültürü adı verilen yöntemde ihtiyaç duyulan kan miktarı daha azdır. Mikro kültürde kanın uzun süre bekletilmesi, santrifüj edilmesi, elle oynanması gibi sakıncalı olabilecek durumları ortadan kaldırdığından, makro kültür yöntemine göre daha elverişlidir.



Fetus

0.2 ml

Yenidoğan

0.1 ml

Kord kanı

0.3 ml

Çocuk (< 5 yaş)

0.5 ml

Çocuk (> 5 yaş) ve erişkin

0.8 ml


Tablo 2: Genel olarak 10 ml’lik tüm kan kültürü için gerekli olan kan miktarları.

Mikro kültür için gerekli solüsyonlar
1. Besiyeri (Growth medium)


  • RPMI 1640- Temel besiyeridir. Ticari olarak satılan tüm besiyeriler (MEM, McCoy’s 5A, Ham’s F10 vb.) bu amaç için kullanılabilir. Bunlardan herhangi birisinin seçimi kişisel deneyime kalmıştır. 100 ml.

  • Fetal calf serum (Fetal bovine serum)- Kültür ortamını zenginleştirmek ve hücrelerin çoğalma oranını artırmak amacıyla kullanılır. 20 ml.

  • Penisilin ve streptomisin- İşlemler esnasında herhangi bir mikrobik kontaminasyonu önlemek amacıyla kullanılır. 1.3 ml.

  • L-glutamin- L-glutamin stabil olmadığı için kültür kullanılmadan hemen önce katılmalıdır. 1.3 ml.


2. Phytohemagglutinin- Periferik kandaki lenfositler interfazın G0 veya G1 dönemindedirler ve normal olarak periferik kanda mitoza girmezler. Lenfositleri kültürde bölünmeye teşvik etmek için mitoz uyarıcısı (mitotic stimulant) kimyasallar kullanılır. En çok tercih edilenleri EBV (Ebstein-Barr virus) ve Phaseolus vulgaris’den elde edilen Phytohemagglutinin’dir. Phytohemagglutinin iki formda bulunur M ve P. Kültürde kullanılanı M formudur. 1.5 ml.
Mikro kültür yukarıda miktarları verilen solüsyon ve kimyasalların steril kabinde karıştırılmaları ile hazırlanır. Kültürün pH’sı 7.2-7.4 arası olmalıdır. Bunu ayarlamak için sodyum bikarbonat (NaHCO3) veya Hepes buffer kullanılır. Yine steril kabin içersinde hazırlanan mikro kültür 10 ml olarak kültür flasklarına veya 15 ml’lik falkon tüplere bölünür. Her bir hasta için bu 10 ml’lik bölünmüş mikro kültür kan ekimi için kullanılır. Bu aşamada kullanılan tüm flask ve tüpler kesinlikle steril olmalıdır.

Hastadan alınan kan kültür flaskları içersine Tablo 2’de belirtildiği miktarlarda eklenir. Daha sonra kan ekilmiş kültürler, memeli hücreleri için optimum üreme ısısı olan 37oC’lik etüv içersinde 72 saatlik inkübasyona alınırlar. 72 saatin sonunda harvest işlemine geçilir.


Harvest için gerekli solüsyonlar
1. Kolşisin (Colchicine) solüsyonu- Mitoz bölünmenin metafaz aşamasına gelmiş olan hücrelerin bir sonraki evreye, yani anafaza geçmelerini engellemek için 72 saatini dolduracak olan kültürlerin son 20. dakikasında eklenir. Bu madde etkisini kromozomları hücre kutupkarına çekmekle görevli mitotik iğ iplikçiklerini parçalayarak gösterir. 20 μl.

2. Hipotonik solüsyon- Kültürdeki hücrelerin şişerek parçalanmalarını ve kromozomların birbirlerinden iyice ayrılmalarını sağlar. En çok kullanılan hipotonik solüsyon 0.075 M’lık KCl solüsyonudur.

3. Fiksatif- En sık kullanılan fiksatif metanol-asetikasit fiksatifidir (3/1 oranında). Fiksatif her kullanım öncesi yeni olarak hazırlanır. Fiksatif hipotonik solüsyon muamelesi sonucu açılmış olan metafaz plaklarının tespit edilmesini sağlar.
72 saatin sonunda (kolşisin eklenmiş olan) kültürler etüvden alınarak, dikkatlice konik dipli santrifüj tüplerine aktarılır ve 1000 rpm’de 10 dk santrifüj edilir. Üstteki süpernatant atıldıktan sonra tüpün dibindeki pellet üzerine 8ml hipotonik solüsyon eklenir ve 5 dk 37oC’lik etüv içersinde bekletilir. Bekleme sonunda tüpler dikkatlice santrifüj edilerek üstte kalan süpernatant atılır, kalan pellet üzerine fiksatif damla damla eklenmek suretiyle 5 ml’ye kadar tamamlanır. Bu işlem esnasında fiksatif pellet ile iyice karışmalı hatta düşük rpm’li bir vorteks mikser kullanılmalıdır. Bu ilk fiksatif muamelesinin ardından 15 dk oda ısısında bekletildikten sonra tüpler tekrar santrifüj edilir ve üstteki süpernatant atılarak fiksatif işlemi en az iki defa daha tekrarlanır. Son fiksatiften sonra dipteki pelletin yoğunluğuna dikkat edilerek 1 ml’ye kadar daha fiksatif eklenir, bu aşamada fiksatif içersindeki hücreler artık lamlara yayılarak preparat haline gelecek son şekillerindedir.
Preparatların hazırlanması
Kromozom analizinin en önemli ve kritik aşamasındır. Bu aşamada yapılan yayma kromozomların lam üzerinde düzgün açılmalarını ve kromozom kalitesini belirleyecektir. Lamların önceden iyice temizlenmesi iyi ve temiz preparatlar için önemlidir. Bu aşamada havanın bağıl nem oranı preparatın niteliğini etkilemektedir ve en iyi sonuçlar % 50-60’lık bağıl nemde alınmaktadır. Bir diğer etkende ortam ısısıdır, ısının optimum olduğu değer 23–25 oC’dir. Nem ve ısı laboratuardan laboratuara değişebilmektedir. En uygun şartlar zaman içersinde optimize edilebilir.
Preparatların tripsin ile bantlanarak boyanması

Bantlama yapılmadan önce yeni yayılmış olan preparatların 3 gün oda ısısında veya bir gün 60 oC’lık etüvde bekletilerek yaşlanmaları sağlanmalıdır, bu süreç iyi bantlama için gereklidir. Preparatların bantlanması özellikle grup içi kromozomların birbirinden ayrılması ve yapısal kromozomal bozuklukların görülebilmesi için önemlidir. 32 oC’lik su banyosu içersinde aktifleştirilen tripsin (bir tür proteaz) buffer içersine preparatlar 4sn-3dk kadar olan zaman aralığında daldırılarak tripsinin etki etmesi sağlanır. En uygun tripsin süresi deneme yoluyla bulunur. Tripsinden sonra preparatlar giemsa boyası içersinde 2 dk boyanır. Boyama işleminden sonra preparatlar ışık mikroskobu altında incelemeye hazırdır.





Figür 14: Kromozom analizinin aşamaları.



Figür 15: DNA’nın paketlenmesi.






Yüklə 59,91 Kb.

Dostları ilə paylaş:




Verilənlər bazası müəlliflik hüququ ilə müdafiə olunur ©www.genderi.org 2022
rəhbərliyinə müraciət

    Ana səhifə