Masarykova univerzita přírodovědecká fakulta

Ethylhexyl methoxycinamát

Ethylhexyl methoxycinamát (EHMC, CAS: 5466773), patřící do skupiny chemických (organických) UV filtrů, je viskózní bezbarvá až světle žlutá kapalina bez zápachu s bodem tání 25 °C a bodem varu 160 °C (při 1 hPa). Jedná se o organickou sloučeninu, která je tvořena kyselinou methoxyskořicovou a 2ethylhexanolem. Její rozdělovací koeficient log K_OW je 5,8. Látka je nerozpustná ve vodě.

Ethylhexyl methoxycinamát je nejpoužívanější UV filtr v Evropě i ve světě. V Evropě byla provedena studie četnosti EHMC v používaných opalovacích krémech. Ze 75 opalovacích krémů byl EHMC nalezen v 49 % přípravků, dalším nejčastějším UV filtrem byl butyl methoxydibenzoylmethan (v 44 %) (Rastogi 2002). V USA byl EHMC obsažen v 90 % opalovacích prostředků (Brown 2000).

EHMC vytváří ochrannou vrstvu a zůstává na povrchu kůže nebo proniká do vrstvy stratum corneum. Studie transdermální penetrace ukazují, že jen malé množství (<3 %) z dermálně aplikovaného EHMC může být vstřebáváno do kůže (NTP 2008). Velká část EHMC je distribuována ve stratum corneum u dospělých lidí. Při použití EHMC u dětí, kde je vrstva stratum corneum mnohonásobně tenčí, je ale pravděpodobné, že může být penetrace mnohonásobně vyšší. Navíc děti mohou mít méně vyvinutou eliminační kapacitu s ohledem na expresi a aktivitu cytochromu P450 a glukuronidaci (vznik glukosiduronátů ve II. fázi biotransformace) (NTP 2008).

EHMC chrání před UV zářením indukující spálení, imunosupresi a rakovinou kůže tím, že absorbuje UVB záření.

O EHMC je známo, že poměrně rychle degraduje na slunci. Při působení UV záření dochází k isomerizaci jeho stabilnější transformy na cisformu (Pattanaargson et al. 2004). Podrobněji je tento proces popsán v kapitole 3.5. Fotoisomerizace EHMC a jiných UV filtrů.


Obr. 1: Označení optických isomerů. Převzato z (Kroutil 2005).
Cistrans isomerie je rozdílné relativní uspořádání substituentů na dvojné vazbě nebo na planarizovaném kruhu. Pro dvojnou vazbu se symbolů cis/trans užívá pouze, jdeli o relativní konfiguraci stejné dvojice (vzhledem ke koncům dvojné vazby) substituentů, jinak se používá obecnějších stereodeskriptorů E/Z (Kroutil 2005). Správné označování je popsáno na obrázku 1. Ačkoli je v případě EHMC správnější označení E/Z, rozhodla jsem se v diplomové práci popisovat jednotlivé optické isomery EHMC jako cis a trans. Označení jsem zvolila z toho důvodu, že je mnohem používanější a pro ty, kteří nejsou odborníky v organické stereochemii, srozumitelnější. Dalším důvodem byl fakt, že ve většině dostupných článcích se u EHMC používá označení cis/trans mnohem častěji. Navíc označení cis/trans v anglicky psané literatuře je mnohem volnější, dokonce v hrubé Elielově učebnici organické stereochemie (Eliel et al. 2001) se doporučení, kdy použít E/Z a kdy cis/trans, skoro vůbec neřeší.

Označení cisEHMC tedy odpovídá isomeru ZEHMC a označení transEHMC odpovídá EEHMC. Rozlišení optických isomerů EHMC pomocí symbolů cis/trans je použito v celé diplomové práci.

1. Toxicita EHMC

V této kapitole jsou shrnuty informace o potenciální nebezpečnosti EHMC. Veškerá níže uvedená data o toxicitě se týkají pouze isomeru trans, tedy stabilnějšího optického isomeru, neboť v této formě se EHMC vyskytuje za běžných podmínek.

Celková data o toxicitě EHMC udávají, že tato látka nevykazuje akutní toxicitu, není kožním ani očním iritantem, není kožně senzibilizující ani fotoreaktivní (o tom svědčí studie na fototoxicitu a fotocitlivost) (SCC 1996).

V testu na kontaktní hypersenzitivitu ale vykázal senzibilizační potenciál při dermální aplikaci na myších samicích (NTP 2012a). Byly zaznamenány otoky uší při aplikaci 1% roztoku EHMC v olivovém oleji, přičemž největší nárůst otoku byl zaznamenán při dávce 25% roztoku EHMC.

EHMC může být štěpen na 4methoxyskořicovou kyselinu, 2ethylhexanol a 2ethylhexanovou kyselinu (2-ethylhexanol i 2-ethylhexanová kyselina jsou považovány za vývojově toxickou látku) (NTP 2008). Metabolismus této látky by měl být detailněji studován, aby bylo zjištěno, jaký je skutečný potenciál vzniku těchto metabolitů. Další informace o této problematice nejsou známy.

EHMC byl testován v dvougenerační vývojové studii na potkanech (Schneider et al. 2005). Bylo zjištěno, že EHMC nemá nežádoucí účinky na estrální cykly, chování při páření, zabřeznutí, porod a laktaci, EHMC neměl negativní účinky na spermie a velikost vajíček, ani na makropatologii či histopatologii pohlavních orgánů. Při denní dávce 1000 mg.kg¹.den¹ byla pozorována snížená konzumace potravy u dospělců, což mělo vliv na tělesnou váhu (pokles o 14 až 16 % u samců a 4 až 5 % u samic).

Estrogenní potenciál EHMC byl potvrzen v řadě studií (spolu s jinými UV filtry) (Gomez et al. 2005; Schlumpf et al. 2001). Některé studie přímo vyzývají k omezení používání EHMC v opalovacích přípravcích z důvodu jeho multiorganické endokrinní aktivity (Klammer et al. 2005).

S rostoucím povědomím o nebezpečnosti UV záření, jsou sunscreeny používány k ochraně po celou dobu života člověka, což vede k chronické expozici těmto látkám. V důsledku toho může docházet k expozici plodu v děloze. Tento expoziční scénář by měl být zahrnut do hodnocení nebezpečnosti EHMC a také všech sunscreenů.

2. Karcinogenita, genotoxicita EHMC

Byla provedena studie některých sunscreenů pro důkaz mutagenní aktivity na bakteriálních kmenech Salmonelly typhimurium (Bonin et al. 1982), kdy u látky ethylhexyl methoxycinamát byl opakovaně potvrzen genotoxický potenciál. Mutagenní testy při použití miskové zkoušky byly provedeny dle stanovených metod (Ames et al. 1975) a se standardními bakteriálními kmeny TA100, TA98, TA1535, TA1537 a TA1538. Toxicita a genotypové reverze mutantních kolonií byly pečlivě monitorovány.

Všechny látky kromě EHMC vykázaly negativní výsledky. Všechny pozitivní výsledky (tedy signifikantní genotoxicita) u vzorků EHMC byly zjištěny se stejným kmenem TA1538 a bez metabolické aktivace (bez přítomnosti S9 mixu). Výsledky vzorků, které vykázaly nejvyšší genotoxicitu, jsou uvedeny v tabulce 2.

Tabulka 2: Výsledky genotoxicity EHMC v Ames testu. Upraveno a převzato z (Bonin et al. 1982). Podtržené výsledky jsou ty, které v testu měly minimálně dvojnásobnou odpověď než kontrola.

V souhrnu toxikologických informací týkajících se EHMC (SCC 1996) je uvedeno, že nebyla prokázána žádná iniciační aktivita nádorů a EHMC se rovněž neprojevil jako promotor vzniku nádoru. Soubor dat neprokázal ani mutagenitu či genotoxicitu in vivo ani in vitro v přítomnosti či nepřítomnosti UV expozice. Jediný pozitivní výsledek byl zaznamenán právě ve výše uvedeném Ames testu (Bonin et al. 1982).

V následující kapitole jsou shrnuty pojmy, které jsou důležité pro pochopení problematiky, mechanismů a efektů genotoxických látek.

1. Genotoxicita – vymezení pojmů

Genotoxicita neboli mutageneze je proces, při kterém dochází k poškození DNA vlivem mutagenních faktorů (mutagenů). Někdy je mutageneze spojována s karcinogenezí, mutagen s karcinogenem. Toto zaměnění je chybné, neboť každý karcinogen je mutagenem, ale ne u každého mutagenu byla prokázána karcinogenní aktivita.

Mutagenní faktory

Mutagenní faktory dělíme dle jejich povahy a podstaty na:

1. 
   Chemické mutageny: působí na základě chemické modifikace nukleotidu a mění polynukleotidový řetězec. Do této skupiny mutagenních faktorů patří například arylační, alkylační látky jako jsou yperit, benzo(a)pyren, které vytváří tzv. adukty s bázemi nukleových kyselin. Dále sem patří interkalátory (např. fluorescenční barviva), které způsobují deaminaci, hydroxylaci či štěpení vazeb v DNA a RNA. Jako chemické mutageny mohou působit také různé syntetické analogy bazí, které se párují s „komplementárními“ bazemi během replikace a způsobují tak substituční mutace. Typickými zástupci jsou produkty spalování, PCB složky umělých hmot, potravinářská barviva, apod.
   
2. 
   Fyzikální mutageny: patří sem zejména ionizační a UV záření. UV záření způsobuje mutace při replikaci, tyto mutace se shromažďují v kožních orgánech, které nás chrání před škodlivým působením UV. Při nadměrném vystavování UV záření může dojít k nahromadění mutací a to zapříčiní vznik rakoviny kůže.
   
3. 
   Biologické mutageny: řadíme sem biologicky aktivní částice, jako jsou viry a transpozony (segmenty v DNA, které jsou schopny měnit svou pozici v genomu).
   

Mutageny můžeme také dělit z hlediska biochemického mechanismu působení na přímé a nepřímé mutageny:

1. 
   Přímé mutageny jsou faktory, které svou vlastní podstatou a složením mohou způsobovat změny v DNA
   
2. 
   Nepřímé mutageny jsou samy o sobě neškodné a mutagenní charakter získají až po metabolické aktivaci, která umožňuje jejich zpracování organismem.
   

Mutace

Mutace jsou změny v genotypu organismu oproti normálnímu stavu. Většina mutací vzniká náhodně. Mutace cílená je používána téměř výhradně pro vědecké účely.

Mutace můžeme dělit na spontánní a indukované dle okolností jejich vzniku. Spontánní mutace vznikají bez vnějšího zásahu, k chybě dochází při replikaci DNA. DNA polymeráza je velmi přesná, tudíž pravděpodobnost jedné takovéto chyby se pohybuje v řádech asi 10⁷. Navíc buňky jsou schopné do jisté míry tyto chyby díky reparačním enzymům likvidovat. Většina mutací je vyvolaná mutagenními faktory (indukované mutace).

Podle úrovně, na které je genetická informace ovlivňována, můžeme mutace dělit na:

1. 
   Genomové: jsou to nejrozsáhlejší typy mutací, týkající se celého genomu nebo jeho velkých částí chromozomů. Nejrozsáhlejší změnou je znásobení celé chromozomální sady (polyploidie).
   
2. 
   Chromozomové: tyto mutace se odehrávají na úrovni jednotlivých chromozomů (chromozomové aberace). Následky chromozomálních zlomů závisí na tom, zda je i po strukturní přestavbě zachováno normální množství genetické informace. Pokud ne, potom dochází k fenotypovým projevům. Strukturní změny chromozomů můžeme rozdělit na balancované (kde je zachováno původní množství genetické informace) a nebalancované (kde není zachováno původní množství genetické informace a jejich nositel může mít různě závažné fenotypové projevy).
   

Chromozomové přestavby klasifikujeme podle mechanismu vzniku jako:

• 
  Duplikace: znásobení úseku chromozomu
  
• 
  Delece: část chromozomu chybí
  
• 
  Inzerce: následek minimálně tří chromozomálních zlomů, kdy dojde k začlenění části chromozomu, který byl vyštěpen z jiného chromozomu
  
• 
  Inverze: vyštěpení části chromozomu, převrácení a následné napojení
  
• 
  Translokace: část chromozomu je vyštěpena z původního chromozomu a připojena k jinému
  

3. 
   Genové: tyto mutace probíhají na úrovni vlákna DNA, jsou to tedy změny, které mění pořadí nukleotidů oproti normální sekvenci. Mutace, které se týkají pouze jednoho nukleotidu, označujeme jako mutace bodové. Podle mechanismu vzniku rozlišujeme:
   

• 
  Adice: zařazení jednoho či více nadbytečných nukleotidových párů, pokud je zařazen počet nukleotidů, který není násobkem 3, dojde k posunu čtecího rámce a tedy k syntetizování zcela jiného polypeptidu nebo dokonce k předčasnému ukončení proteosyntézy vznikem terminačního kodonu.
  
• 
  Delece: ztráta jednoho nebo více nukleotidů původní sekvence, účinek je podobný jako u adice, dochází zde naopak ke zkracování řetězce. Opět může dojít ke změně čtecího rámce.
  
• 
  Substituce: náhrada, či záměna báze původní sekvence bází jinou. Jako transcizi označujeme ten případ, kdy jde o záměnu purinové báze za purinovou bázi, nebo o záměnu pyrimidinové báze za pyrimidinovou bázi. Jako transverze se označuje záměna purinové báze za bázi pyrimidinovou nebo naopak.
  

Citlivost živých organismů vůči genotoxinům není absolutní. Během vývoje si vyvinuly opravné mechanismy, které zajišťují odstranění nežádoucích změn v genetickém materiálu vedoucí k rakovině či dědičným poškozením. Nejjednodušším opravným mechanismem je excize bazí a excize nukleotidů, které patří mezi bezchybné opravné mechanismy. Tímto mechanismem lze opravit pouze jednodušší formy poškození DNA (Seeberg et al. 1995). Další významný opravný mechanismus závažných poškození je spojen s homologní rekombinací (Moustacchi 2000). Dalším opravným mechanismem, který ale není bezchybný a nemusí vést (s jistou pravděpodobností) k opravení genetické informace do původního stavu, je SOS reparační systém. SOS odpověď je indukována prostřednictvím více než 20 genů jako odpověď na genotoxický zásah jako je mutace, rekombinace, vznik zlomů v řetězcích DNA. Ústřední roli v SOS systému hrají dva SOS geny lexA a recA. Poškozením DNA je iniciován přepis genu recA, který stimuluje proteolýzu represorového proteinu LexA. Po odstranění proteinu LexA (bránící přepisu ostatních SOS genů) je umožněn přepis SOS genů spojen se zahájením SOS odpovědi (Little and Mount 1982). Zároveň se přepisuje i DNApolymeráza III, která se podílí na opravě poškozeného úseku v molekule DNA (Frank et al. 1993; Rajagopalan et al. 1992). Ztráta schopnosti opravovat poškození DNA je příčinou mnoha genetických chorob a mutantní linie buněk vykazují zvýšenou citlivost k environmentálním genotoxickým faktorům.

3. Imunotoxicita a alergenní potenciál EHMC

Imunitní systém reaguje na cizorodé vysokomolekulární látky, zejména bílkoviny. Základní součástí imunitního systému je lymfatický systém (lymfatické uzliny a žlázy, slezina) a bílé krvinky (leukocyty). V případě, že je nějaká látka, antigen rozpoznána jakožto cizí, začnou se proti ní produkovat protilátky, které tvoří s antigenem komplex a tím jej inaktivují. Imunitní odpověď se pak může projevovat mírnými kožními projevy, kopřivkou, dýchacími potížemi či anafylaktickým šokem. Imunotoxické látky mohou tyto reakce potlačit nebo naopak vyvolat alergickou reakci. Řada jednoduchých chemikálií působí právě imunosupresivně, tedy tlumí imunitní reakci. Patří sem například benzen, PAHs, PCBs, ozon. Alergickou reakci mohou vyvolat mnohé reaktivní organické látky, např. toluendiisokyanáty, pfenylendiamin, pyly a prachy různého původu (Horák et al. 2004).

U EHMC byly zjištěny imunomodulační účinky ve vyšších koncentračních dávkách (Rachon et al. 2006) v testu in vitro na produkci interferonu (IFN)gamma a interleukinu (IL)10.

UV filtry jsou testovány hlavně z hlediska alergenní reakce na kůži. Co může být ale mnohdy opomíjeno, je alergická reakce po aplikaci a po pobytu na slunci, tedy při současné expozici UV záření. Na světle dochází k řadě reakcí, které by mohly zapříčinit i vyšší citlivost na složky opalovacího krému, popřípadě na fotodegradační produkty. Je tedy potřeba znát zejména u sunscreenů jejich fotoalergenní potenciál, nejen alergenní reakce na samotnou aplikovanou látku.

UV filtry byly testovány na iniciaci fotoalergické kontaktní dermatitidy (Rodriguez et al. 2006), kdy bylo potvrzeno, že řada opalovacích krémů má fotoalergenní potenciál u některých citlivějších jedinců. Fotoalergická dermatitida je charakterizována zarudnutím, pupínky a puchýřky v místě exponovaném působení fotoalergenu a UV záření. Vzniká pouze u jedinců, kteří mají přecitlivělost na určitý alergen. V tomto testu vykázal fotoalergenní potenciál nejčastěji benzophenone3 (BP3) u 22 z 82 exponovaných pacientů, dalším nejčastějším fotoalergenem byl EHMC, který byl potvrzen u 8 z 82 exponovaných pacientů, dále benzophenone4 (BP4) a benzophenone10 (BP10) (2/82), phenylbenzimidazole sulphonic acid (PBSA), 4methylbenziliden camphor (4MBC) a octyl dimethyl PABA (1/82).

4. Testy EHMC laboratoře EnTox

EHMC byl ve všech dosavadních testech hodnocen pouze jako isomer transEHMC, jelikož se v této formě vyskytuje v 99,9 % za normálních podmínek. Expozice z hlediska možné fotodegradace a vzniku isomeru cisEHMC nebyla dosud dostatečně diskutována. Existují informace o fotodegradaci této látky, nikoli však o možných rozdílech v toxických efektech těchto dvou isomerů. Přitom jsou známy látky, jejichž isomery mají prokazatelně jiné vlastnosti a liší se i svými toxikologickými vlastnostmi. Příkladem může být trans a cisdichlorodiaminplatina (CDDP) (Roberts and Friedlos 1987), dále HCH a jeho isomerní formy (Willett et al. 1998), α a βasarone (ether, který se vyskytuje v rostlinách jako acorus a asarum) (Unger and Melzig 2012) nebo velmi známý lék thalidomid a jeho optické isomery (Nishimura et al. 1994).

První zmínky o testování jednotlivých produktů EHMC po ozáření na světle (tedy při působení UV záření) pochází z laboratoře EnTox. Laboratoř EnTox (National Research Center for Environmental Toxicology, Australia) se zaměřuje na získávání nových poznatků o zdrojích, osudu, expozici a účincích znečištění životního prostředí.

Byl připraven roztok EHMC v etanolu o koncentraci c = 530 µg.ml¹ a ten byl ponechán na slunci po dobu sedmi dní. Ozářená směs EHMC obsahovala 31 % cisEHMC a 69 % transEHMC. Tato směs spolu s neozářeným EHMC byla testována na imunotoxicitu a estrogenní potenciál. Výsledky testů jsou uvedeny v následujících kapitolách (v současné době se výsledky připravují k publikování).

1. Test imunotoxicity

Pro tento test se nejčastěji používají lidské alveolární buňky A549, které spolu s bronchiálními buňkami jsou schopny produkovat cytokiny s potenciálním významem pro imunotoxicitu (Roggen et al. 2006).

Test byl proveden pomocí Human IL8 DuoSet ELISA kit, který je určen pro detekci IL8 v supernatantu buněčných kultur. Tento test využívá techniku kvantitativní sendvičové enzymové imunoanalýzy, která měří IL8 v době kratší než 5 hodin. Polyklonální protilátka specifická pro lidský IL8 byla předvrstvena do jamek mikrotitrační destičky. IL8 ve standardu a vzorcích je „sendvičována“ imobilizovanou protilátkou a polyklonální protilátkou (na kterou je kovalentně vázaný biotin) specifickou pro lidský IL8, která je rozpoznána konjugátem streptavidinperoxidázou. Nenavázaný materiál je potom spláchnut a do jamek se přidá enzymový substrát. Po přidání chromogenního substrátu se barva změní z modré na žlutou. Intenzita barvy se měří spektrofotometricky.

Graf 1: Závislost stimulačního faktoru na koncentraci EHMC v jamce (ng/jamku). Fialová křivka udává prozánětlivý potenciál  imunotoxicitu EHMC, tedy původní primární směsi, ve které převládá transEHMC; zelená křivka prozánětlivý potenciál ozářené směsi EHMC, která obsahovala 31 % cisEHMC a 69 % transEHMC. Zdroj: EnTox.

Z výsledků můžeme vidět, že ozářené EHMC obsahující směs isomerů cis a trans v poměru 31 % ku 69 % má v tomto testu rozdílnou odpověď než primární látka EHMC, která je z 99,9 % tvořena isomerem trans. Ozářená směs vykázala na rozdíl od standardu měřitelný imunotoxický potenciál.

2. Estrogenní potenciál EHMC

Pro zjištění estrogenního potenciálu byl použit Escreen test (Soto et al. 1995), který je založen na schopnosti množení buněk MCF7 v přítomnosti estrogenů. Tento kvalitativní test porovnává počet buněk, kterých je dosaženo stejným inokulem MCF7 buněk za nepřítomnosti estrogenů (negativní kontrola) a za přítomnosti 17βestradiolu (pozitivní kontrola).

V laboratoři EnTox byl proveden test estrogenity EHMC na buňkách MCF7 (poskytnuté Ana Soto, Tuft University School of Medicine, Boston MA, USA), které byly kultivovány na médiu při 37 °C 24 hodin. Test byl proveden na 96jamkové mikrodestičce. Buněčná hustota byla 5000 buněk na jednu jamku.

Estrogenní účinnost vzorku je vyčíslena porovnáním jeho schopnosti indukovat buněčnou proliferaci v kultuře buněk rakoviny prsu MCF7 a 17βestradiolu.

Byly srovnány dva vzorky, standard EHMC a ozářená směs EHMC obsahující isomery cis a trans v poměru 31 ku 69%. Jako standard byl použit standardní estrogen E2. Výsledky je možné sledovat v grafu 2. Graf znázorňuje proliferaci buněk v závislosti na logaritmu koncentrace vzorku. Čím je vyšší estrogenita, tím je vyšší proliferace screeningových buněk. Proliferace byla měřena spektrofotometricky. Absorbance byla měřena spektrofotometricky při 490 nm.

Graf 2: Závislost absolutní hodnoty absorbance měřené při 490 nm na logaritmu koncentrace testovaných látek. Červená křivka představuje standardní estrogen E2, který byl použit jako pozitivní kontrola pro test estrogenní aktivity Escreen assay. Fialová křivka představuje ozářený vzorek EHMC (obsahující 31 % cisEHMC a 69 % transEHMC), zelená křivka znázorňuje neozářené EHMC. Zdroj: EnTox.

Z grafu můžeme vidět, že se obě varianty vzorků (ozářené i neozářené EHMC) chovají jako endokrinní disruptory. Ozářená směs isomerů při tom vykázala vyšší estrogenní potenciál než neozářený standard EHMC. Tento fakt vyzývá k další studii a provedení dalších testů, kde by odpovědi těchto isomerů mohly být rovněž rozdílné.

Z výsledků laboratoře EnTox je zřejmé, že ozářená směs obsahující cisEHMC měla zcela jinou odpověď v testech imunotoxicity a estrogenní aktivity. Nabízí se tedy hypotéza, že právě fotoprofukt cisEHMC je zodpovědný za vyšší toxický potenciál v těchto testech. Proto by tato látka (cisEHMC) měla být studována také jako samostatně izolovaná, aby byly detailněji ověřeny její efekty. V diplomové práci jsem se rozhodla tuto hypotézu ověřit. Navrhnout vhodnou metodu pro ozařování EHMC s co největším výtěžkem cisEHMC a jeho následnou separaci ze směsi a tento produkt otestovat na genotoxicitu a estrogenní aktivitu.

2.