Işik mikroskopik teknikler

PO₄ + AgNO₃  Ag PO₄

Ag PO_4, gümüş indirgeyici hidrokinon ile muamele edilir ve siyah renkte metalik gümüş izlenir.


B. Enzimlerin Gösterimi:

• 
  Asit fosfatazın gösterimi (Gomori): Lizozomlarda bu enzim çoktur.
  

Doku +Sodyum gliserofosfat Asit fosfataz Gliserol +PO₄

PO₄ +PbNO₃  PbPO₄ - elektron mikroskopta görülebilir.

PbPO₄ + (NH₃) SO₃ Pb SO₃ - ışık mikroskobunda siyah olarak izlenir.

• 
  Dehidrogenazların gösterimi:
  

Tetrazol bileşiği hidrojen iyonunu alarak renkli farmazan bileşiğini oluşturur.

• 
  Peroksidazların gösterimi:
  

Doku +H ₂O₂ (peroksidazın substratı) +DAB (3,3 diamino azo benzidin)  2 H₂O + DAB’ın siyah renkli oksidasyon ürünü.

Bu reaksiyonda dokulardaki hidrojen iyonunu hidrojen peroksit kullanır.

• 
  Lipidlerin gösterimi: Dondurma mikrotomu ile kesitler alınır. Suda eriyen, alkolde erimeyen indifferent boyalarla (Osmik asit, Oil Red O, Sudan 3,4 Scharlach Rot) boyama yapılır. Glikolipidler için de yöntemler vardır.
  

• 
  Nükleik asitlerin Gösterimi:
  
• 
  DNA, Feulgen reaksiyonu ile gösterilir.
  

DNA + HCL  DNA’daki serbest aldehitler açığa çıkarılır. Ardından Schiff ayıracı (rengi alınmış bazik fuksin) ile muamele edilir.

DNA olan alanlar menekse-mor renkte saptanır. Floresans bir boya olan acridin orange ile DNA , sarımsı- yeşil renkte ortaya konur.

• 
  RNA; Metil green pyronin ve acridin orange ile boyanır. RNA’nın bazik boyalara yüksek affinitesi vardır. Kesitlerin kontrolu RNA-az ile yapılır. Bazofilinin kaybolduğu alanlar RNA alanlarıdır.
  

DNA+akridin orange  sarımsı –yeşil

RNA+akridin orange  kırmızı

• 
  Proteinlerin Gösterimi: İmmunositokimya, immünohistokimya, immuno-enzimatik ve immuno-floresans yöntemlerle gösterilirler.
  

• 
  Karbohidratların gösterimi: Homopolisakkaritlerden glikojen ve nişaşta PAS + reaksiyon verir.
  

• Glikojen + periyodik asit  serbest aldehitler + Schiff reaktifi (H₂SO₄ ya da metabisülfitle rengi açılmış bazik fuksin) ile menekşe-mor renkte boyanır.

• 
  Glikozaminoglikanlar: COOH, SO_4, OH ve fosfat gruplarından dolayı polianyonik ve hidrofiliktirler. Alcian blue gibi bazik boyalarla kuvvetli boyanırlar. Asidik glikozaminoglikanlar ve asidik glikoproteinler alcian blue ile boyanırlar.
  

İNCELEME YÖNTEMLERİ

Makroskobik Yöntemler: Histolojide çıplak gözle inceleme yöntemleri de kullanılır.

Mikroskopik Yöntemler:

MİKROSKOPLAR

En çok kullanılan mikroskoplar, bir objenin büyütülmüş görüntüsünü oluşturan görünebilen ışığı kullanan optik mikroskoplardır. En basit optik mikroskop, kısa odak uzaklığı olan çift konveks mercektir. Çift konveks mercekler objeyi 15 kez büyütebilirler. Bileşik mikroskoplarda kapalı bir borunun iki ucuna monte edilen objektif ve oküler mercek olmak üzere 2 mercek kullanılır ve 2000 kez daha büyük büyütmelere ulaşılabilir. Klasik ışık mikroskobu, aydınlık alan mikroskobu olarak da adlandırılır. Araştırma mikroskoplarında 2 ya da daha fazla objektif mercekler kullanılır.

Özel Amaçlı Optik Mikroskoplar:

Steromikroskoplar: Yansıyan ve geçen ışın kullanarak embriyolar, bağırsak villusları incelenebilir. Çoğunlukla diseksiyonda kullanılır.

Inverted Mikroskoplar: Hem sanayide hem de biyolojik bilimler de kullanılır. Biyolojik bilimlerde genellikle hücre ve doku kültürlerindeki canlı hücrelerin incelenmesi için kullanılır. Kültür şişeleri mikroskoba yerleştirilerek incelenir.

Polarizasyon Mikroskobu (Petrografik mikroskop): Kayaçların ve Işığı çift kıran, yönlendiren anizotrop maddelerin (çizgili kas, kemik matriksi, kolesterol, selüloz, bazı kristaller, mikrotubullerin). Nikol prizma veya başka bir polarize kaynakla örnekten geçen ışık polarize edilir. Diğer bir Nikol prizma ya da analizer ise ışık örnekten geçtikten sonra ışığın polarizasyonunu saptar ve kayaçların mineral yapısı ölçülür ve saptanır.

KONTRAST MİKROSKOPLAR

Karanlık Saha Mikroskobu: Şeffaf, boyanmamış veya boyanmış biyolojik örneklerin ve normal aydınlatmada mikroskopta görülemeyen çok küçük objelerin (kolera bakterisi, spiroketler gibi) incelenmesinde ve hareketlerinin saptanmasında kullanılır. Bu mikroskopta mikroorganizmalar, karanlık zemin üzerinde parlak görüntü verirler. Özel kondansatörler yardımıyla sağlanan karanlık sahada, alttan gelen ışık, kondansatörün ortasındaki siyah, ışık geçirmeyen bir bölge nedeniyle yanlarından girerek preparat üzerine gelir. Bu sistemde ışık tüp içine girmeyerek yanlara dağılım gösterir. Ancak, karanlık alanda bulunan mikroorganizmanın yansıttığı ışık, mikroskobik inceleme yapan kişinin gözüne ulaşır.

Faz-Kontrast Mikroskobu: Genellikle canlı dokuların incelenmesinde kullanılır. Boyanmamış canlı biyolojik örneklerin incelenmesinde kullanılabildiği gibi boyanmış ölü dokularda da kullanılır. Işığın farklı kırılma özelliği ile sıvı bir ortam içerisinde boyasız olarak incelenen mikroorganizmaların hücre iç yapılarının görülmesini sağlar. Klasik ışık mikroskobundan iki önemli farklı olarak özel kondansatör ve özel faz objektifleri kullanılır.

Nomarski Differensiyel Interferans Kontrast Mikroskobu: Bu mikroskoplarda kullanılan Nomarski merceklerinde canlı ve cansız objeler 3 boyutlu olarak incelenir. Floresans uygulamalarda da kullanılır. Jeolojik kullanımı da vardır.

Hoffman Kontrast Mikroskobu: Hücre ince yapılarındaki membranların gösteriminde çok kullanışlıdır. Keskin görüntüler verir.

Ultraviyole Mikroskobu: Kısa dalga boylu ultraviyole ışınları kullanılır. Ultraviyole ışınları camdan geçemediği için bu mikroskoplarda kuartz, florit ve aliminize-ayna sistemleri kullanılır. İnsan gözü ultraviyole ışınları göremediğinden görüntü fosforesans, fotografi veya elektronik scanning ile görünür hale getirilir. Nükleik asitlerin, proteinlerin incelenmesinde kullanılır. Günümüzde geliştirilerek floresans mikroskoplara dönüşmüştür.

Floresans Mikroskopu: Hem kızıl ötesi hem de mor ötesi ışınlar kullanılır. Artıkmaya başlanmıştır. Kısa dalga boyu ile ışınlandıklarında daha uzun dalga boyunda görünebilir ışınların oluşması floresans olarak adlandırılır. Floresans, doğal ve yapay olmak üzere 2 tiptir. Vit A, Vit B₂, porfirinler, nükleik asitler doğal floresans veren maddelerdir. Yapay floresans ise flurokrom boyalarla sağlanır. Floresans mikroskopta, flurokrom boyalarla işaretlenmiş antikorların kullanılmasıyla hücre ve doku antijenlerinin yerleri saptanır (immünofloresans).
Konfokal Mikroskop: Floresan veya yansıtıcı problar ile işaretlenmiş kemik, beyin ve diğer benzeri dokuların oldukça kalın kesitleri, gelişmekte olan embriyolar gibi küçük organizmalar ve bütün haldeki hücre örnekleri çalışılır. Bu teknoloji araştırmacılara ulaşılabilecek en yüksek ışık mikroskobu çözünürlüğü ile hücre altı yapılar, fonksiyonları ve hücre/organizma yapısının temiz bir şekilde görüntülenmesini sağlar. Bu işlem tek veya çoklu işaretlenmiş örneklere uygulanır. Konfokal mikroskobun avantajı tek bir plandan gelen ışığı toplayabilmesidir (Konfokal=Aynı odağa sahip olan).

Elektron Mikroskobu: Elektron kaynağı olarak ısıtılmış tungsten bir filamandan çıkan ve vakum içinde hızlandırılmış elektron demeti kullanılır. Elektronlar camı gecemediğinden cam mercek içermezler. Elektrostatik ve elektromanyetik alanlar kullanarak büyütme sağlanır. Transmisyon (geçirimli-TEM) elektron mikroskobu tipinde ultratomla alınan nanometre kalınlığındaki kesitlerin 2 boyutlu olarak hücre iç detayları gözlenir. Cismin görüntüsü 1 milyon kez büyütülerek floresans ekranda izlenir. Scanning (taramalı-SEM) de ise ince kesit alınmasına gerek yoktur ve 3 boyutlu olarak hücre yüzey topografisi hakkında bilgi edinilir. Objeleri 100 000 ya da daha fazla büyütebilir. Sanayide de çok kullanılır (Tekstil ipleri, yün özellikleri, lastik, porselen sanayi gibi).

X-ışınları Mikroskobu: Bu mikroskopta vakum kullanılmaz. Bir çok biyolojik materyal optik mikroskoplarla ve X-ray difraksiyonu ve elektronmikroskop gibi daha yüksek çözümleme güçlü mikroskoplarla çalışmak için çok küçüktür. Canlı hücreler ve çok küçük biyolojik partiküller için çok kısa süreli yoğun x-ışınları lazer atışının kullanılmasına 2000’li yıllarda başlanmıştır. 1 nm’den küçük moleküller ve atom yapılarının aydınlatılmasında kullanılır. Optik mikroskoplarla izlenemeyen çok küçük tek hücreli organizmalar (örn.500 nm den küçük olan picoplankton) bu mikroskopla incelenebilmektedir.

Ayrıca; yakın alan mikroskobu, elektron probe mikroanalizer, scanning prop mikroskobu, scanning tunneling mikroskobu ve atomik kuvvet mikroskopları da geliştirilmiştir ve cismin yüzeyindeki atom ve moleküllerinin 3 boyutlu görüntüsü elde edilir.

Histolojik Gözlemleri Kaydetme: Yapılan gözlemler kaydedilmelidir. Kayıtlarda dokuların yapısı için nitel terimler kullanılmalıdır. Nitel ifadelerle de doku alanı, hacmi, sayıları kesin ve karşılaştırmalı terimlerle ifade edilmelidir. Gözlemler fotograflanmalıdır.

RUTİN HİSTOLOJİK TAKİP

1-Parça alma

2-Tespit

3-Sudan kurtarma

4-Şeffaflandırma

5-Gömme

6-Kesit alma

7-Boyama

8-Kapatma

PARÇA ALMA: Parçalar ölümden, biyopsiden ve cerrahi işlemden hemen sonra veya en kısa zamanda alınmalıdır. Büyük parçalar, dokunun ezilmesini önlemek için çok keskin bistüri veya jiletle daha küçük parçalara ayrılmalıdır. Parçaların kalınlığı 2-4 mm’yi (1 mm³) geçmemelidir.

TESPİT: Canlı öldüğünde içerdiği katabolik enzimler nedeniyle otoliz olmaya başlar. Bu olay, ölüm sonrası bozulma (postmortem dejenerasyon) olarak bilinir. Otolizde hücre içi enzim hareketleri değiştiğinden proteinler yıkılarak hücreler sıvı hale geçer. Otoliz, soğukta geçiktirilir, 37 ⁰C‘de hızlanır. 57 ⁰C‘de otoliz tamamen durur. Otolizde beyin, böbrek gibi iyi farklanmış organlar, elastik ve kollajen fibrillere göre daha çok etkilenir. Otoliz olmuş hürelerde çekirdeklerde piknoz, parçalanma (karyoreksis), lizis ve erime (karyoliz) görülür. Sitoplazma şişer ve granüler hale gelebilir. Doku granüler ve homojenöz bir kütle haline gelir ve boyanma reaksiyonlarında azalma olur. Otolizde epitel dökülür ve bazal membrandan ayrılır. Glikojen miktarı azalır ve tespit olmadığından dokuya yayılır.

Bakteriler de dokularda otolize benzer sonuçlar çıkarır. Septisemide hastadaki bakteriler ya da normal flora bakterileri çoğalır. Tespit ile tüm bakteriler ölür.

Tespitin (fiksasyonun) amacı:

1-Hücre ve dokuların canlı hale en yakın biçimde muhafaza etmektir. Ancak bu tam gerçekleştirilemez.

2-Otolizi, bakteriyel bozuma ve çürümeyi önlemek.

3-Kolaylıkla diffüzyon olan maddelerin kaybını önlemek.

4-Sağlığa zararlı kötü etkilere karşı dokuyu kuvvetlendirmek.

5-Dokunun boyalarla ve diğer reaktiflerle boyanmasını kolaylaştırmak.

Fiksasyonda doku proteinleri ve yapı taşları koagüle olur. Böylece takip sırasında kayıpları ve diffüzyonları en aza iner. Ancak koagülasyon, dokularda artifakta yol açaçaktır. Bir fiksatif, takip sırasındaki haraplayıcı etkilere karşı koruyucu olmalıdır. Taze dokular suda yıkanırsa hücreler patlar. Önce tespit uygulanırsa yıkamanın etkisi olmaz.

Fiksasyon, dokuların kırma indislerini değiştirerek optik differansiyasyon sağlar. Bazı hücre bileşenlerinin kırma indisi çevreleyen ortama çok yakın olduğundan klasik mikroskopla incelendiğinde görülemezler. Fiksasyon, boya hareketlerini kolaylaştırır. Çekirdek boyası carmalum, formalin fiksasyonunda az, civa klorür boyasında ise daha iyi boyar. Bazen tespit ajanı özel doku bileşeni ve doku arasında mordant gibi hareket edebilir. Hematoksilen ile miyelin gösteriminde dokunun potasyum dikromatla bu şekilde hareket eder.

Fiksasyonla proteinler, tuzlar, karbohidratlar veya lipitler çökertilir ve doku sertleşir, katılaşır. Doku sertleştiğinden ince kesitlerin alımı kolaylaşır. Fiksatifteki kimyasalların etkisiyle enzimler inaktifleşir veya muhafaza edilir. Fiksatif seçilirken, dokunun boyutu, tipi, tazeliği ve uygulanacak boya bilinmelidir. Bir fiksatif bütün dokular ve boyalar için ideal değildir.

FİKSASYONUN UYGULANMASI: Fiziksel (ısı, kurutma ve dondurma) ve kimyasal yolla yapılabilir. Isı ile fiksasyon, bozulmaya yol açtığından artık kullanılmamaktadır. Kurutma ile fiksasyon, kan ve kemik iliği yaymalarında kullanılır. Dondurma ile fiksasyon, lipitler, enzimler ve ameliyat parçalarının hızlı tespitinde kullanılır. Dondurulan örnekler aynı zamanda sertleştiğinden hemen dondurma mikrotomu ile kesit alınır.

Kimyasal fiksasyon en çok uygulanan yöntemdir. Çeşitli kimyasal maddeler kullanarak fiksatif adı verilen çözeltiler hazırlanır. Alınan örnekler ya fiksatife atılır (daldırma=immersiyon yöntemi) ya da anestezi altında organı besleyen arter yolu ile önce serum fizyolojik verilerek damardaki kan boşaltılır ardından fiksatif verilerek organ daha vücutta iken kısmen tespit edilir. İncelenecek örnekler ardından fiksasyonun tamamlanması için fiksatif çözeltisine daldırılır. Bu yöntemde yapı daha iyi korunduğundan araştırmalarda tercih edilir.

Başarılı Fiksasyon İçin Nelere Dikkat Edilmelidir?

1-Ölümden ve operasyondan sonra alınan örnekler hemen fiksatife atılmalıdır. Örnekler, ışık mikroskopi için kalp durmasından en geç 30 dakika, elektron mikroskopide ise 4 dakika sonra fiksatife alınmalıdır.

2-Fiksatifde kullanılan kimyasallar taze olmalı, titizlikle tartılmalı ve karıştırılmalıdır.

3-Doku parçaları mümkün olduğu kadar küçük olmalıdır.

4-Fiksatif, doku hacminin en az 10 katı, formalin için 20 katı olmalıdır.

5-+4 ⁰C’de fiksasyon önerilir. Düşük ısılar fiksatifin dokuya işleyişini azaltırsa da otolizi önlediğinden doku iyi tespit edilir.

6-İçi boş organlar tespit çözeltisi ile doldurulmalıdır. Böylece tespit çözeltisi dokuya her iki yüzden işler ve iç yüzün düzgün yüzey şekli korunmuş olur.

7-Kırışma ve katlanma olasılığı olan dokular mantar plakalar üzerine gerilmelidir.

8-Kaba önce fiksatif konmalı, parçalar sonra daldırılmalıdır. Yoksa dokular kaba yapışır ve yapışma yerinden tespit çözeltisi dokuya işlemez.

9-Yağdan ve havadan zengin dokular tespit çözeltisinde yüzdükleri için kaset içine alınarak tespit çözeltisine batması sağlanmalıdır.

10-Tespit çözeltisinin dokuya işleyişini hızlandıran işlemlerden kaçınmalıdır. Yüksek ısı tespit çözeltisinin dokuya işleyişini hızlandırırken aynı zamanda otolizi de hızlandırır.

11-Kullanılan tespit çözeltisinin dokulara işleme hızı bilinmelidir. Alkol 5 mm kalınlığındaki bir dokuyu 5 saatte, % 4’lük formalin 4mmlik dokuyu + 4 ⁰C’de 5 saatte tespit eder.

12-Özel amaçlar dışında doku 24 saatten fazla tespit edilmemelidir.

13-Tespit çözeltisi ne hipotonik ne de hipertonik olmalıdır. Osmolaritesi canlı dokunun osmolaritesi (300 mosl) ve ölü dokudakine (450 mosl) uygun olmalıdır. Tespit edilmeyen doku su ile kesinlikle yıkanmamalıdır.

14-Tespit çözeltisinin pH’sı dokunun pH’sına yakın olmalıdır (pH=6-8). Bu nedenle tamponlanmış formalinle dokuların tespit edilmesi daha uygun olur.

15-Fiksasyonda kullanılan kaplar dar boğazlı olmamalı, düz hatlı olmalıdır.

16-Doku çok sertleşmemelidir. Doku aşırı derecede sertleşirse kesit alımı zorlanır. Uzun zaman tespit çözeltisinde kalan ve tespit çözeltisinin buharlaşması ile sertleşen örnekler antiformin çözeltisine (1 g antiformin+5 cc su veya 20 cc konsantre çözelti+80 cc su) konarak veya doku tamamen kuruysa dimetilsülfoksit içinde yumuşatılarak tekrar çalışılabilir.

Akciğerlerin tespiti için trakeal instillasyon önerilir. 100 mm Hg’dan daha az bir basınçlı bir şırınga ile % 10’luk nötral formalin bir dirençle karşılaşıncaya kadar verilir. Ardından akciğerler çıkarılarak 48 saat fiksatife daldırılarak fikse edilir. Akciğerler, formalin buharı ile doygun hale getirilmiş kapalı alanda 5-6 saat bekletilerek de tespit edilebilir.

TESPİT AJANLARI

A-Sıvı Tespit Ajanları

Absolu etil alkol: Glikojeni iyi korur ancak çekirdek ayrıntıları kaybolur ve sitoplazma büzülür.

Soğuk aseton: Lipazlar ve fosfatazlar gibi enzimlerin çalışılmasında kullanılır. Çekirdek ayrıntıları kaybolur ve sitoplazma büzülür ve glikojen iyi korunmaz.

Formaldehit: Ticari olarak % 40’lık formaldehit olarak bulunur. Proteinleri presipite etmez diğer hücre bileşenlerini ise kısmen presipite eder. Lipidler üzerine etkisi yoktur. Bileşik lipidleri iyi korurken nötral lipitler üzerine etkisi yoktur. Formalin karbohidratlar için önerilen fiksatif olmamasına karşın glikojeni korur. Dondurma kesitler için ideal bir fiksatiftir.

Gluteraldehit: Formaldehitten daha yavaş etkiler ve daha pahalıdır. Elektronmikroskopi ve enzim histokimyasında çok kullanılır. Elektronmikroskopide OsO₄’den önce 1. fiksatif olarak kullanılır. Fikse edilen örnekler çözeltide aylarca saklanabilir. Gluteraldehit ile tespit edilen dokular PAS+ reaksiyon vermeye meyillidirler. Fiksasyonda % 25’lik çözeltileri kullanılır.

Trikloroasetik asit: Sülfür grubu amino asitleri iyi korur. Dekalsifiye ajanı olarak kullanırlar.

Asetik asit: Tek olarak kullanılmaz. Dokuya hızlı ve iyi işler ancak alyuvarların lizisine yol açar, kollajen fibrilleri şişirir. Nükleoproteinleri çöktürür. Bazı sitoplazmik granüller üzerine çözücü bir etkiye sahiptir.

B-KATI TESPİT AJANLARI

Civa Klorür: Çok zehirli ve metallere korozivdir. Kaplar ve kapaklar kesinlikle metal olmamalıdır. Metal aletler parafine daldırılarak kullanılmalıdır. Dokuya hızla etki eder ve dokuyu sertleştirir. Dokuyu biraz büzer. Proteinler üzerine etkilidir. Hem çekirdeği hem de sitoplazmayı iyi tespit eder. Diğer tespitleyici ajanlarla birlikte kullanılır. Dokuda civa pigmenti olarak adlandırılan kahverengi-siyah renkte artifakt oluşturur. Dehidrasyon sırasında % 70-% 80’lik alkole % 0.25-0.5 iodin eklenerek uzaklaştırılabildiği gibi boyama basamağında da uzaklaştırılabilir.

1-Ksilol ile parafin uzaklaştırılır

2-% 100’lük alkol

3-% 70’lik alkolle hazırlanmış % 0.5’lik iodin......3-5 dakika

4-Çeşme suyunda çalkalama

5-% 2.5’lik sodyum tiyosülfatla beyazlaşıncaya kadar .....30 saniye-2 dakika

6-Akarsu...........5 dakika

7-Boyamayı yap.

Potasyumdikromat: Çözeltinin pH’sı fiksasyonu etkiler. pH=3.4-3.8 iken sitoplazma ve mitokondri iyi korunurken, nükleoproteinler iyi korunmaz. Daha asidik olduğunda hem çekirdek hem sitoplazma mitokondri harabiyeti ile birlikte presipite olur. Genellikle diğer ajanlarla karıştırılarak kullanılır. Potasyumdikromatla tespit edilen dokular, alkolden geçirilmeden akarsuda yıkanmalıdır. Uzun süre çözeltide bırakılırsa doku gevrekleşir.

Kromik Asit: % 2’lik çözeltileri kullanılır. Proteinleri precipite eder ve karbohidratları tespit eder. Alkol ve formalin ile birlikte kullanılmamalıdır. Fiksasyondan sonra dokular akarsuda yıkanmalıdır.

Pikrik Asit: Isıtılırsa patlayıcı özelliği vardır. Suda oda ısısına % 1 oranında çözünür. Nükleoproteinleri precipite eder. Fiksasyonda suda doygun çözeltisi kullanılır. Fiksasyondan sonra alkole alınmalıdır.

Osmiyum tetroksit: 0.25-0.5 ve 1 g lık ampüllerde satılan sarı renkli kristalli bir maddedir. Kristalin ve çözeltinin dumanı göze ve solunum yollarına zararlıdır. Çalışmalar çeker ocakta yapılmalıdır ve sıkı gözlük kullanılmalıdır. Isı ve ışık etkisi ile çözelti siyahlaşır. 10 cc çözeltiye1 damla suda doyurulmuş civa klorür eklenerek çözelti tekrar kullanılır hale getirilir. Yavaş etki eder fakat lipitler için ideal fiksatiftir. Küçük örnekler, smearler dumanı ile fikse olabilir. Pahalı olduğu için ışık mikroskobunda kullanılmamasına rağmen elektron mikroskobunda 2. fiksatif olarak kullanılır. Fiksasyonda % 2’lik çözeltisi kullanılır.

FİKSATİFLER

Fiksatifler kullanımlarına göre 2 gruba ayrılır.

1-Mikro-anatomik fiksatifler: Bu fiksatifler dokular arasındaki bağlantıları ve geniş hücre kümelerinin diğeri ile bağlantılarını tam korumak amaçlandığında kullanılır.

2-Sitolojik fiksatifler: Hücreyi oluşturan elementler korunur.

HİSTOLOJİDE EN ÇOK KULLANILAN FİKSATİFLER

% 10’luk Formalin

Formaldehit 100 cc

Çeşme suyu 900 cc

% 10’luk Formal-Salin

Formaldehit 100 cc

NaCl 8.5 g

Çeşme suyu 900 cc

% 10’luk Tamponlanmış Nötral Formalin (pH=7.0)

Formaldehit 100 cc

Çeşme suyu 900 cc

NaH₂P0₄. H20 4 g

Na₂HP0₄ 6.5 g
Formalinin nötral olması önerilir. Tampon tuzları ile nötralizasyon sağlanır. Kalsiyum karbonat kullanımı dokularda pseudokalsifikasyona yol açabilir. Ticari formaldehit bazen paraformaldehit oluşumu ile bulanıklaşır ve çözeltinin gücü azalır. Filtre edilirse kullanılabilir.

Formalin renksiz olmalıdır. Sarı çözeltilerde kullanılan demir kaplar nedeni ile kirlenmiştir ve Prusya mavisi reaksiyonu pozitiftir.

Formalin % 10’luk olarak hazırlanır. Hazırlama için çeşme suyu, serum fizyolojik veya tamponlar kullanılır. Bu çözeltiler % 4 oranında formaldehit içerir.

Formalinde dokular aylarca yıllarca kalabilir. Dokunun bazik boyalarla boyanmasında biraz kayıp olur. Bazı gümüş çöktürme yöntemlerinde ise sonuçlar daha iyi olabilir.

İnce bloklar 24-48 saatte iyi fikse olabilir ancak optimum fiksasyon 7-10 gündür. Kandan zengin dokularda kanla asit formalinin etkileşmesi sonucu kahverenkli ekstraselüler formalin pigmenti artifaktı oluşabilir. Nötral tamponlanmış çözeltiler kullanarak pigmentten kurtulunur. Genellikle ölü dokularda görülür ve saklandıkça artar. Kesitleri pikrik asitin alkolde doyurulmuş çözeltisinde 20 dakika bırakarak uzaklaştırılabilir.

Formalin mikro-anatomik fiksatiftir ve bir çok boyama yöntemine uygundur. Nadiren H&E boyanmış kesitlerde çekirdeklerin hematoksilen ile kısmen veya tamamen boyanmaması, bunun yerini eozinin alması ve çekirdek kenarlarında kayıp görülebilir. Daha çok fiksasyonu iyi yapılmış lenfoid ve epitel dokusunda nadiren post-mortem dokularda görülür. Pembe hastalık olarak bilinir. % 10’luk formalindeki %2’lik asetik asit kullanımı ile önlenir. Pembe hastalık oluşmuşsa kesitlerin hematoksilene aktarılmadan absolu alkolde % 1’lik HCl içinde 1 saat bırakılması ile uzaklaştırılır.

Formalin buharı, bazı kişilerde gözü, solunum yolları epitellerini etkiler. Bu nedenle laboratuvarlar iyi havalandırılmalıdır. Saklama kaplarının ağzı sıkıca kapatılmalıdır, korezyona dirençli kaplar kullanılmalıdır. Eldiven veya etkili krem bariyer kullanımı formalin dermatitini önler.

Formalin, ideal bir fiksatif olarak önerilse de çekirdek şişmeleri oluşabilir. Asetik asit formalini ile ikinci fiksasyon uygulanırsa bu olumsuz etki ortadan kaldırılır ve H&E ile parlak boyanma sağlanır. Formalin, kromatlar formik asite oksitleyeceğinden kromatlarla kullanılmamalıdır.

Formalinden çıkan bloklar % 70’lik alkole alınabilir veya frozen kesitler alınabilir.
Alkol-Formalin Çözeltisi

Nötralize edilmiş formalin 10 cc

% 95’lik alkol 90 cc

Bu fiksatifte parçalar 2-4 saatte tespit olur. Doku kalınsa buzdolabında 24 saatte tespit önerilir. Polisakkaritler için iyi bir fiksatiftir.
Alkol Fiksatifleri:Absolu alkol özellikle hücrelerde glikojenin fiksasyonunda kullanılır. Buzdolabında ve düşük ısılarda kullanılmazsa dokuda büzülme olur. 20 ⁰C‘de 2 günde mükemmel tespit eder. % 80’lik alkol fiksatifi ise 5 ⁰C’de 24-48 saatte dokuyu büzmeden tespit eder.

Lison Vokaer’in Alkol Fiksatifi (Glikojen İçin):

% 96’lık alkolde doyurulmuş pikrik asit 85 cc

Asetik asit 5 cc

Formaldehit 10 cc

Küçük parçalar buzdolabında 5-10 saatte tespit edilir. Glikojen için idealdir. Glikojen suda eridiğinden tespitten sonra absolü alkolden geçirilerek gömme işlemi yapılmalıdır.
Civa Klorür-Formalin (Formal süblimat ) Fiksatifi

Suda doyurulmuş civa klorür 900 cc

Formaldehit 100 cc
Bloklar 12-24 saatte tespit edilir. Formal-salinden sonra 2. fiksatif olarak kullanıldığında da mükemmel sonuçlar verir. Metallere korosivdir.
SUSA Fiksatifi (Heidenhain-1916)

Civa klorür 45 g

Sodyum klorür 5 g

Trikloroasetik asit 20 g

Asetik asit 40 cc

Formaldehit 200 cc

Distile su 800 cc
Biyopsiler için uygun bir fiksatiftir. Hazırlanmasında çok madde gerekmesi dezavantajıdır. Formal sublimata göre daha iyi sonuçlar verir. Weigert boyasında elastik lifler iyi boyanmaz.
Zenker Fiksatifi (Zenker-1894)

Civa klorür 5 g

Potasyum dikromat 2.5 g

Sodyum sülfat 1 g

Distile su 100 cc

Asetik asit 5 cc (kullanımdan hemen önce eklenir)

Sitoplazma ve fibriller iyi korunur. Taze materyel için daha uygundur. Eritrositleri iyi korumazlar. Bloklar 3-8 saatte tespit olur. Fazla dikromatı uzaklaştırmak için çeşme suyuyla yıkanırlar. Civa pigmenti önceden açıklandığı gibi uzaklaştırılabilir.
Helly Sıvısı ( Zenker-Formal- Helly-1903)

Civa klorür 5 g

Potasyum dikromat 2.5 g

Sodyum sülfat 1 g

Distile su 100 cc

Formaldehit 5 cc (kullanımdan hemen önce eklenir)

Mükemmel bir fiksatiftir. Özellikle kemik iliği, dalak, lenf bezleri, hipofiz ve pankreas için çok yararlıdır. Bloklar 6-24 saatte tespit edilir ve civa pigmenti önceden açıklandığı gibi uzaklaştırılabilir. Hem mikroanatomik hem sitolojik fiksatif olarak kullanılabilir. % 10’ luk formolden sonra 2.fiksatif olarak kullanılabilir.
Bouin Fiksatifi (Bouin-1897)

Suda doyuruluş pikrik asit 75 cc

Formaldehit 25 cc

Asetik asit 5 cc

Eritrositlerin kısmen ya da tamamen lizisine yol açar. Kollajen fibrilleri şişirebilir. Aşırı sertleşmeye yol açmaz. Sitoplazmik boyalarla parlak boyanma sağlar. Glikojen iyi korunur (özellikle alkollü tipi ile). Hem mikroanatomik hem sitolojik fiksatif olarak kullanılabilir. Bloklar 6-24 saatte tespit olur ve % 70’ lik alkole aktarılırlar. Dokuları sarımsı boyaması dezavantajıdır. Bu renk bazik anilin boyaları kullanmadan önce % 2.5’ lik sodyum tiyosülfat kullanarak uzaklaştırılabilir.
Carnoy Fiksatifi (Carnoy-1887)

Absolü alkol 60 cc

Kloroform 30 c

Asetik asit 10 cc

Dokuya çok hızlı işler. Acil tanı için tercih edilir. Glikojen ve kromozomlar iyi korunur. 3 mm den kalın olmayan dokular 30-90 dakikada tespit olur ve ardından % 95’lik ya da % 100’lük alkole transfer edilmelidir.
Sanfelice Fiksatifi (Sanfelice-1918)

Çözelti A

Formaldehit 128 cc

Asetik asit 16 cc

Çözelti B

% 1’lik kromik asit 100 cc

Karışım=9 cc Çözelti A+ 16 cc Çözelti B
Mitotik figürler ve kromozomlar için ideal bir fiksatiftir. 3 mm den kalın olmayan dokular 12-24 saatte tespit edilir. Ardından akarsuda yıkanır. Sitolojik fiksatiftir.
Flemming Fiksatifi (Flemming-1884)

% 1’lik kromik asit 15 cc

% 2’lik Osmiyum tetroksit 4 cc

Asetik asit 1 cc veya daha az

Taze hazırlanmalıdır. Dokuya işlerlik eşit olmayabilir. Yüzey tabakaları kararabilir. Formalinden sonra 2.fiksatif olarak kullanıldığında miyelin ve lipitler iyi gösterilir. 2 mm kalınlığındaki parçalar 12-48 saatte tespit olur. Ardından akarsuda yıkanır.
Orth Fiksatifi (Orth-1896)

Formaldehit 10 cc

Müller sıvısı (potasyum dikromat 2.5 g+Sodyum sülfat 1 g+Distile su 100 cc) 100 cc
Taze olarak hazırlanmalıdır. Mitokondri iyi korunur. Bloklar 24-48 saat tespit edilir. Çeşme suyuyla yıkanır. Potasyum dikromat dokuyu sertleştirebildiğinden kesit alımı zorlaşabilir.
DOKU TAKİBİ

Doku takibinin amacı, dokuyu desteklemek için yeterince sert bir katı ortama gömmek ve kesitlerin alınması için gerekli sertliği vermektir. Doku bıçağı zedeleyecek kadar sert olmamalıdır. Rutin histoloji içi ideal gömme ortamı parafindir. Doku parafine gömülmeden önce şu işlemlerden geçirilmelidir.

1-Fiksasyonun tamamlanması

2-Sulu fiksatifi ve doku sıvısını uzaklaştırmak için hafif fakat tatmin edici bir dehidrasyon

3-Hem kendinden önceki dehidrasyon ajanı ile hem de gömme ortamı ile karışabilen bir madde ile şeffaflandırma

Doku Takip Hızını Etkileyen Faktörler

1-Ajitasyon:Bazı otomatik takip aletleri dikey, bazıları dönme hareketi ile ajitasyon uygular. Ajitasyon hızı önemlidir. Çok düşük hız etkisizken, çok yüksek hız ise yumuşak dokularda harabiyete yol açar. 25-30 cm/ dk , her iki ajitasyon için de uygundur.

2-Isı:Isı takip hızını artırırken, soğuk azaltır. Dokuları gevrekleştirdiğinden ve takip basamaklarında yanıcı maddeler bulunduğundan fazla ısıtmamaya dikkat edilmelidir.

3-Viskozite:Viskozite arttıkça dokuya penetrasyon hızı azalır.

4-Ultrason:Ultrason kullanımı önerildiği halde pek kullanılmamaktadır.

5-Vakum:Parafinden geçirilme evresinde kullanılır. Bazı otomatik takip aletlerinde takibin tüm basamaklarında vakum kullanılır. Dehidrasyon ve şeffaflandırmada fazla avantajı yoktur ancak dokudaki hava kabarcıkları bu yolla uzaklaştırılır.
Sert Dokuların Takibi:Tendon, tırnak, fibröz doku, keratin kütleleri normal şekilde takip edilebilir fakat takipten önce bu dokular % 70’lik alkolle hazırlanmış % 4’ lük fenol ile veya gliserol, alkol-anilin oil karışımdan geçirilirse yumuşar ve daha iyi sonuçlar alınır.

3-SUDAN KURTARMA (Dehidrasyon):Tespitten sonra suyun ve bazı sıvıların uzaklaştırılması gerekir. Dehidrasyonda genellikle alkol ve aseton kullanılır. Dokular genellikle fazla miktarda su içerir. Bu suyun çıkarılmasıyla erimiş parafin doku parçalarının boşluklarına girebilir. Tespitten çıkarılan dokular genellikle yıkanır. Ardından % 30-50’lik etil alkolle başlayarak %60-70-80-96-96-100-100-100’lük etil alkolden birer saat geçirilir. Böylelikle dokular büzülmeden sudan kurtarılır. Embriyonik dokular gibi hassas dokularda dehidrasyonun % 30luk basamakla başlaması önerilir.

Dehidrasyon Sıvıları

1-Etanol: Şeffaf, renksiz, yanıcı, hoş kokulu ve hidrofiliktir. En çok tercih edilen dehidranttır.

2-Ticari Endüstriyel Metilenmiş Ruh: Etanole biraz metanol eklenerek hazırlanmış bir dehidranttır.

3-Metanol: Biraz pahalı ve tehlikeli bir dehidranttır.

4-Propan-2-ol-ipopropil alkol: Dokuları etanol gibi sertleştirmez.

5-Aseton: Şeffaf, renksiz, yanıcı, keskin kokulu ve diğer dehidrantlara göre daha uçucudur. Etanol ve metanolden daha hızlı hareket eder. Asetonda uzun süre bırakım, dokuları gevrekleştirir.

5-Katı dehidrantlar:Bakır sülfat anhidrit kullanabilir. Tuzu beyazdır ancak suyu çektiğinde mavileşir.

6-Kimyasal dehidrasyon:

2,2-dimetoksipropan 100 cc

HCl 0.05 cc

Fiksasyondan sonra dokular yıkanır. Tek basamakta ve kısa sürede doku dehidre edilir. Ancak rezinlerin çoğu ile ve erimiş parafinle karışmaz. 2,2-dimetoksipropan fiksatifle veya dehidrantla birleştirilerek de kullanılabilir.

4-ŞEFFAFLANDIRMA (Clearing): Bu terim, dehidratlayıcı ajanı uzaklaştırmak için seçilmiş sıvının uygulanmasından sonra dokuların görünümünü ifade etmektedir. Doku bu işlemle yarı şeffaf hale getirilir. Bir şeffaflayıcı ajandan esas beklenen hem dehidrantla hem gömme ajanı ile karışabilir olma özelliğidir. Şeffaflandırıcı ajanı seçerken şunlara dikkat edilmelidir.

1-Alkolü uzaklaştırma hızı

2-Erimiş gömme ortamı ile uzaklaştırılmasının kolaylığı

3-Dokulara karşı nezaketi

4-Yanıcılık

5-Toksisie

6-Fiyat

Yanıcı olduklarından dikkatli kullanılmalıdır. Otomatik takip aletleriyle işlemde geniş ve dens bloklar için süre uzatılmalı ancak küçük parçalar etkilenmemelidir.

Şeffaflandırmada, ksilen, toluen, kloroform, benzen, karbontetrakorür, propilen oksit (özellikle e.m.de), karbondisülfit, amilasetat, sedir yağı, karanfil yağı trikloroetilen kullanılabilir. Genellikle 2-3 değişim bu sıvılardan geçirilerek dokular şeffaflandırılır ve parafinin işlemesine uygun hale getirilir.

5-PARAFİNE GÖMME (Embedding):Gömme ortamı olarak parafin, selloidin, selloidin-parafin kullanılabilir. Amaç, dokuları yarı sert ve kolayca kesilen materyel içine yerleştirmek ve şeffaflandırıcı ajanı dokudan uzaklaştırmaktır. Parafin en çok kullanılan ortamdır. Uygun takip hızı ve seri kesit için uygun kıvamı vardır. İstenilen kalınlıkta kesit alınabilir. Erime derecesi 45-50 ⁰C olan parafin yumuşaktır. 56-60 ⁰C’ lik ise daha serttir. Ortam ısısı, gömülecek mataryelin yapısı ve kesit kalınlığına uygun parafin seçilmelidir. Sıcak iklimde 45⁰C’lik parafinle 3-5 µm lik kesit almak zordur.

55-60 ⁰C’ lik parafin etüvündeki 3 kap erimiş parafinden geçirilen örnekler cam veya fayans üzerinde L-biçimli Leuckhart plakları ile hazırlanan kalıplara yerleştirilir. Kalıba önce erimiş parafin, ardından istenilen yönde doku yerleştirilir ve tekrar kalıp parafinle doldurulur. Bir etiket yerleştirilerek soğumaya bırakılır.

Gömme Hataları:

1-Parafin dokuya işlememişse bloklar iyi kesilemez, yırtılır.

2-Sıvı parafin çok sıcak ise doku büzülür.

3-Hızlı hareket edilmezse hava kabarcıkları, kristaller oluşabilir.

6-KESİT ALMA (Sectioning): Mikrotom ile 5-7 µm lik kesitler alınır. Bıçak keskin olmalı ve uygun açıda kullanılmalıdır. Kesitler, açılmaları için 45-50 ⁰C’lik ben mariye atılır. Ben mariye kesitlerin lama kolay yapışması için jelatin eklenebilir. Ben mari soğuksa kesitler açılmaz, çok sıcaksa ani açılma ile yırtılabilir. Kesitler lama alınarak havada ya da etüvde kurutulur.
7-BOYAMA (Staining): Dokuları ilk kez Leuwenhoek (1719) safran kullanarak boyamaya çalışmış ve başaramamıştır. Boya endüstrisinin gelişmesi ile carmin boyası ile dokular hafifçe renklendirilmiş, Gerlach (1858)’ de tesadüfen cerebellumu boyayabilmiştir. 1863’te hematoksilen kullanılmaya başlanmış, 2 yıl sonra Böhmer mordant olarak alum kullanmış ve başarılı olmuştur. Anilin boya endüstrisinin gelişmesi ile dokular mükemmel olarak renklendirilebilmiştir.

Boyanmamış preparatlarda doku elemanlarının kırma indisleri birbirine yakın olduğundan ayrıntılar izlenemez. Farklı boyalar kullanarak dokular ve hücre bileşenleri birbirinden ayrılabilir. Doku bileşenlerinin ayırt edilmesi için kullanılan histolojik tekniklerde ya doku kontrastında değişiklik veya renkte değişiklik yapılır. Doku kontrastında değişiklikler faz-kontrast ve polarize mikroskobu ile veya metal çöktürme yöntemleri ile gerçekleştirilir. Histolojik boyama yöntemlerinde genellikle boya ile boyanma ile renk oluşturulur. Böylelikle boyanmış dokunun içinden geçen ışığın dalga boyu değiştirilir.

Genellikle dokular asit ve bazik boya ile boyanırlar. Bazik boya ile boyanan doku elemanları bazofilik; asit boya ile boyananlar ise asidofilik olarak adlandırılırlar. Genel olarak bazik boyalar dokuları mavi-mor, asit boyalar ise pembe-kırmızı renklerde boyar.

Boyalar sulu bir çözelti içinde anyon ve katyonlarına ayrılır. Boyaların renk verme özellikleri anyon ve katyonlardaki boya taşıyan organik gruplara bağlıdır. Eğer boya taşıyan grup katyonda ise boya bazik (katyonik); anyonda ise asit (anyonik) bir boyadır.

Dokularda protein, lipoprotein ve glikoproteinler amfoteriktir. Yani pH’ya ve diğer çevre şartlarına bağlı olarak iyonize olabilirler. Bir protein elektrik yüküne ve boyanmanın olduğu pH’ daki yüküne göre boyanır. Proteinin negatif ve pozitif yüklerinin eşit olduğu pH’ ya o proteinin izoelektrik noktası denir. İzoelektrik noktalarında proteinler çok az boyanır. İzoelektrik noktasının üstünde anyonik gruplarının iyonize olması ile bazik boyalarla; altında ise katyonlarının iyonize olması ile asidik boyalarla boyanır. Proteinlerin amino asit içerikleri farklı olduğundan farklı izoelektrik noktaları vardır.

NEDEN BOYALAR DOKULARCA ALINMAKTADIR?

Bekli de alınmamaktadır. Negatif boyamada yapıların şekilleri boyanın işlemesinden değil boya ile çevrelendiğinden gösterilmektedir. Bazen boyalar yenir. Boyalar organizmanın fizyolojik aktivitelerine bağlı olarak canlı hücre içine alınabilir (vital-supravital boyama). Boya alınımı, boya-doku veya reaktif-doku affiniteleri ile olur. Bazı doku bileşenleri, bazı boyalar için yüksek affinite gösterirler ve daha yoğun boyanırlar. Dokuya boyayı bağladığı düşünülen Coulomb, hidrojen bağı ve diğer bağlar gibi çekici kuvvetleri de açıklamak için kullanılabilir. Affinite, bir boyanın kesite transfer olma eğilimin bir ölçümü olarak düşünülebilir ve sürece eklenen veya engelleyen her faktöre bağlı olabilir.

DOKULARIN BOYANMASI
1-Vital Boyama:Daha önceden açıklandığı gibi canlı hücre ve dokuların az toksik vital boyalarla gösterilmesidir. Makrofaj sistemi hücreleri ve mitokondriler bu yöntemle gösterilirler.

2-Seçilen Çözünürlükte Boyama:Dokularda çözünen maddeler lizokromlar olarak bilinir. Lizokromlar, lipitlerde çözünür ve lipitlerin gösterilmesi (Sudan boyaları, Oil Red O) için kullanılır. Lizokromlar, lipitlerde yüksek çözünür olmalı ve seçilen tercihli çözünürlükler hariç diğer hücresel yapılara affinitesi olmamalıdır.

3-Dokularda Renkli Kimyasal Ürünlerin Oluşması: Bazı boyama yöntemlerinde, dokularla reaksiyona girerek renkli maddeler üretecek olan soluk veya renksiz çözeltiler kullanılır. Bu reaksiyonun sonunda oluşan renkli ürünler ya gerçek boyalar veya boya olmayan renkli kimyasal ürünlerdir.

Birinci gruba örnek olarak PAS reaksiyonunda kullanılan Schiff reaktifi ve Feulgen reaksiyonu verilebilir. Asitle hidroliz edilen (periyodik asit ve HCl) dokularda ortaya çıkan aldehitler, daha önceden rengi alınmış bazik fuksinle muamele edilirse renkli fakat boya olmayan ürün oluştururlar.

İkinci gruba örnek olarak demirin gösterilmesinde kullanılan Perls reaksiyonu verilebilir.

Potasyum ferrosiyanid+ Fe⁺³ (Dokudaki)_.+HCl_{...............}Potasyum ferrik ferrosiyanid (Prusya mavisi)

Ürün olan Prusya mavisi bir boya değildir fakat mikroskopta mavi renkte izlenebilen, koyu boyanmış çözünmeyen bir tortudur.

Dokulardaki enzimler de enzim histokimyasında buna benzer şekilde renklendirilebilirler. Son ürünler opak ve koyu boyanmış olmalıdır.

Örneğin dokulardaki fosfatazlar aşağıdaki gibi gösterilebilir.
Doku+Gümüş nitrat ...........................................Gümüş fosfat

Gümüş fosfat+hidrokinon (indirgeyici ajan )........Gümüş (siyah)

4-Metalik Çöktürme:Bazı metalik bileşikler dokular tarafından opak, genellikle siyah birikinti oluşturarak metalik duruma indirgenebilirler. Kolayca indirgendiğinden ve depo edilmiş gümüş stabil olduğundan Ag(NH₃)₂OH çözeltileri histoloji için çok uygundur. Melanin gibi tirozin türevleri ve intestinal bezlerin Kultschitzky hücrelerinde bulunan fenolik bileşikler Ag(NH₃)₂OH’ ı görülebilen birikim oluşturarak indirgerler. Bu tip hücreler arjentaffin hücreler olarak bilinir. Ag(NH₃)₂OH’ ı direkt olarak indirgeyemeyen fakat dışarıdan eklenen bir indirgeyici ajanla gerçekleştiren hücreler argirofil hücreler olarak bilinir.

Metalik çöktürme sinir hücre uzantıları ve retiküler fibrillerin gösteriminde standart bir yöntemdir. Metalik çöktürme ile gösterim, dokulardaki indirgeyici ajanlar yeterli güçte ise tek basamaklı bir tekniktir. Fakat fibrillerin çöktürme ile gösteriminde argirofil hücrelere benzer olarak genellikle 2 basamaklı indirgenme olur. Gümüş yerine altın da kullanılabilir.

5-Doğal ve Yapay Boyalarla Boyama:Genellikle dokular bu şekilde renklendirilir. Doğal boyalara örnek olarak hematoksilen ve carmin verilebilir. Hematoksilen, Haematoxylen campechianum türü ağaçtan elde edilir. Doğal formunun boyama yeteneği yoktur. Hava ile temas ederek doğal yoldan ya da sodyum iodat veya civa oksitle hemateine okside olursa boyama özelliği kazanır. Carmin ise Dactylopius cacti (kırmız böceği) nin kurutulmuş gövdelerinden elde edilir.

Yapay boyalarsa, kömür-gaz endüstrisinde kömürden elde edilen organik bileşiklerdir. Son yıllarda petrol yağları da önemli bir kaynak haline gelmiştir.

Şekil 1: Boya bileşiklerinin benzen halka yapısı:a-Benzen, b-Quinone, c-Anilin

Benzen, renksiz bir bileşik olmasına rağmen, ultraviyole bandında bir absorbsiyon bandına sahiptir. Gözlerimiz ultraviyole ışığa duyarlı olsaydı benzen renkli görünecekti. Benzenden renkli bir bileşik oluşturmak için bazı kimyasal değişiklikler yapılması gerekir. Renk oluşturan kimyasal yapılar kromofor olarak adlandırılır. 3 tip kromofor vardır. Bunlar; quinoid halka ( genellikle paraquinoid, bazen orto- quinoid), azo eşlenme ve nitro gruplanmadır.

Şekil 2:Kromoforlar.(a) paraquinoid halka. (b) orto-quinoid halka.(c) azo eşlenme. (d) nitro gruplanma.
Quinoid Boyalar:Asit ve bazik fuksin, kristal viyole, anilin mavisi, eozin, thionin, metilen mavisi, nötral kırmızı, hematoksilen ve carminik asit

Azo Boyalar:Orange G, Congo Red, tripan mavisi

Nitro Boyalar:En küçük boya grubudur. Pikrik asit, aurantia
Daha karmaşık organik bileşiklerde bir quinoid halkanın bulunuşu daha koyu parlak renkler oluşturur. Kromoforları içeren bileşikler kromojenler olarak bilinir. Dokuları ve kumaşları renklendirirler. Oluşan renkler sabit değildir. Basit çözeltilerle yıkama ile kolaylıkla uzaklaşabilirler. Kromojenler, çözeltilerde moleküller oluşturarak çözünürler. Halbuki iyi boyalar iyonlar şeklinde çözünürler. Bir kromojeni gerçek bir boyaya çevirmek için iyonize edici bir grubun ortama verilmesi gerekir. Bu iyonlaştırıcı gruplara auxochrom adı verilir ve rengin yoğunluğunu artırırlar. Oksokromlar asidik veya bazik olabilirler. En önemli bazik oksokrom amino (NH₂’ ) grubudur. Asidik oksokromlar ise sülfür, karboksil ve hidroksil gruplarıdır. Bazik grup baskın olduğundan, bir bazik ve bir asidik gruba sahip boyalar baziktir. Ancak asidik grubun varlığıyla boyama özelliği zayıflamıştır. Boyalar, değiştirici (modifiyer) olarak adlandırılan kimyasal gruplar da (CH₃, C₂H₅) içerirler. Boyanın rengini değiştirirler. Rosanilin, pararosanilinden rengi biraz daha mavi yapan bir metil grubuna sahip olmasıyla ayrılır. Eğer bazik amino oksokromların hidrojenleri metil veya aril grupları ile yer değiştirirse boya daha mavi olur. Kristal viyole birden fazla modifiere sahip boyalara örnektir. Bir kromofor ile renklendirilmiş, bir oksokromla iyonize edilmiş bir boyanın son rengi modifiyer ile değiştirilebilir veya kuvvetlendirilebilir.



Şekil 3:Boyaların yapıları: a-Quinoid boya (hematein), b-Azo boya (orange G), c-Nitro boya (pikrik asit)
6-Asidik, Bazik ve Nötr Boyalar:Asidik ve bazik boyalar, çözeltide iyonize olurlar. Bazik boya; katyonik (+) boya iyonları ve (-) yüklü renksiz klor iyonları oluşturur. Asidik bir boya ise anyonik (-) yüklü renkli boya iyonları ve (+) yüklü sodyum iyonlarını içerir. Boyalar için kullanılan asidik ve bazik terimleri pH ile ilgili değildir ve bazik boya için katyonik boya; asidik boya içinse anyonik boya terimi kullanılmalıdır. Katonik bazik boyalar klorür köklerinden dolayı kısmen asittir. Asit boyalar ise sodyum tuzlarıdır ve kısmen alkalidir.

Nötr bir boya; bir asidik ve bir bazik boyanın etkileşimi ile olur. Hem katyon hem de anyon kromoforik gruplar içerir. Boya molekülünün her 2 kısmında renkli bir boya vardır. Büyük moleküller içerdiğinden çözeltileri sıklıkla koloidaldir. Nötr boyalar alkolde çözünürken suda nadiren çözülürler. Asidik ve bazik boyalar ise her ikisinde de çözünür. Nötr boyaların en iyi örneği kan boyalarından Romanowsky boyalarıdır. Polikrom metilen mavisi ve eozinin etkileşimi ile şekillenirler. Metilen mavisinin metilen azur’ e oksidasyonu boyaya özel seçicilik özelliği verir.

Şekil 4: Bazik ve asidik boyalar: a-bazik fuksin, b-asit fuksin

Amfoterik boyama; belli bir pH’ nın altında (izoelektrik nokta) katyonik; bu pH’ nın üstünde anyonik boya ile gerçekleştirilir. Karminik asit izoelektrik noktası pH=4.5 olan amfoterik bir boyadır.

Bazik boyalar, çekirdek gibi asidik yapıları boyarlar. Asidik boyalar ise sitoplazma gibi bazik yapıları renklendirir. Nötr boyalar ise hücrelerdeki asidik ve bazik yapılara ilgi duyarlar. Bazı doku bileşenleri aynı zamanda üçlü boyama etkisi veren bileşik nötr boya ile reaksiyona girerler.

7-Renksiz Lökobazlar: Bazı boyalar, kolaylıkla indirgenebilirler. Eğer kromofor haraplanırsa, boya rengini kaybeder. Lökoboyalar (löko-metilen mavisi), vital boyamada oksidasyonla tekrar renklenirler. Eğer oksijen basıncı düşerse, metilen mavisi ile boyanan yapılar tekrar renksizleşir (lökobaz);oksijen verilerek tekrar renklendirilir. Oksitleme ajanı için test olarak kullanılmadığından Schiff reaktifi (lökofuksin) gerçek bir lökobaz değildir.

8-Metakromatik Boyama: Bazı doku bileşenleri boyalarla birleştiklerinde boyanın orijinal renginden ve dokunun diğer bölümlerinde oluşan renkten farklı bir renk oluştururlar. Bu olay metakromazi olarak bilinir. Bu şekilde hareket eden boyalar ise metakromatik olarak adlandırılır. Metakromatik boyanın rengini değiştirebilen madde ise kromotrop olarak bilinir. Ortokromotik terimi ise metakromazi göstermeyen doku ve boya için kullanılır.

Metakromatik boyaların birden fazla absorbsiyon spektrumu vardır. Bunlar ortokromatik ve metakromatik doku-boya bileşikleri arasında göze çarpan kontrastı vermek için yeteri kadar farklı olmalıdır. Kıkırdak, bağ dokusu, epitelyal musin, bazofil ve mast hücre granülleri, amyloid metakromazi gösteren yapılardır. Metakromatik boyalar ise toluidin mavisi, thionin gibi thiazinlerdir. Metil viyolede sıklıkla kullanılmaktadır.

Şekil 5:Thiazine boya yapısı (thionin)

Ortokromatik doku ile toluidin mavisinin absorbsiyon spektrumu 630 nm’ de maksimumdur ve ortaya çıkan renk mavidir. Metakromatik doku ile maksimum absorbsiyon 480-540 nm dir ve renk kırmızıdır.

Alfa metakromazi.............mavi.........................negatif

Beta metakromazi............menekşe-mor...........kısmen pozitif

Gama metakromazi..........kırmızı......................kuvvetli pozitif
Metakromazi oluşması için dokunun yüzeyinde serbest negatif elektrik yüklü gruplar (sülfat, karboksil, fosfat..) bulunmalı yani polianyonik olmalıdır. Sülfatlı glikozaminoglikanlar bu yapılardan zengindir. Asidik grupların azalması metakromazide düşüşe neden olur. Boyamadan sonra kesitler alkolle sudan kurtarılırsa metakromazi genellikle kaybolur.
Dominiçi Boyası ile Mast Hücrelerinin Gösterimi

Çözelti 1:

• 
  % 0.5 Eozin Y 100ml
  
• 
  % 0.5 Orange G 100 ml
  
• 
  Bu ikisi karıştırılır.
  

Çözelti 2:

• 
  %0.5 Toluidin Blue 100 ml
  

Çözelti 1’de 7 dakika bekletilir, hızla çeşme suyunda yıkanır, çözelti 2’de 20 saniye bekletilir.