Işik mikroskopik teknikler

IŞIK MİKROSKOPİK TEKNİKLER

Prof. Dr.Emel KOPTAGEL

Histoloji, dokuları inceleyen bir bilim dalıdır. Dokuların yapısının araştırılması yanı sıra hücrelerin ayrıntılı yapısını da araştırır. Canlı dokuların mikroskopik incelenmesi ile ideal sonuçlara ulaşılır. Dokuların çoğu canlı olarak incelenemeyecek kadar kalındır. Histolojik teknikler, canlı dokuya en yakın biçimde korunmuş ve tespit edilmiş ölü dokulara uygulanır. Ölü dokulardan hazırlanan preparatlarda artifakt olarak adlandırılan değişiklikler ortaya çıkar. Artifaktlar farklı işlem basamaklarında ortaya çıkabilir.

Sitolojik ve histolojik çalışmalarda amaç, organizmayı oluşturan hücre, doku ve organların normale yakın bir şekilde morfolojilerinin korunmasıdır. Hücreler çok küçük yapılar olduğundan hazırlanan preparatlar farklı tip mikroskoplarda incelenir. Preparat hazırlamak için bir çok teknik vardır. Tek bir yöntem, tek bir boyama yöntemi dokunun tüm hücrelerini ve hücre bileşenlerini ayrıntılı olarak veremez. Çok az bir doku örneğinin boyanması ile morfoloji; histokimyasal ve immünolojik yöntemlerle işlevleri ve elektron mikroskopi ile de ince yapı özellikleri ortaya konur. 1830’da histokimya ayrı bir bilim dalı olarak gelişimine başlamıştır. 1899-1928 yıllarında anilin boyaların histolojide kullanılmaya başlamasıyla bu dalda büyük bir atılım olmuştur.
HİSTOLOJİDE KULLANILAN YÖNTEMLER
1-Preparasyon Yöntemleri

Taze hücre ve Dokular: Zarlar gibi çok ince yapılar, kan ve lenf gibi sıvısal örnekler, derialtı bağ dokusu hücreleri direkt olarak incelenebilir. Doku kalın ise veya katı ise izotonik çözeltide parçalara ayrılarak incelenebilir. Taze preparatlarda hücreler gerçek yapılarını yitirmeden incelenebilir ancak kontrast azlığından dolayı vital boya uygulanmalı ya da faz kontrast mikroskop kullanarak incelenmelidir. Vital boyama yapılarak, hücre, doku ve organ kültürleri ile ya da hücrenin fraksiyonlara ayrılması ile (0,25 molarlık sukroz içinde santrifüjleme veya sukroz ile gradiyentleyerek dansite gradient santrifügasyon) canlı inceleme yapılabilir.

Vital boyama ile hücrelerin sitoplazmasına renk ve kontrast kazandırılır. Vital boya çözeltisine canlı hücrelerin katılması ile (supravital boyama) ile canlıya vital boyanın injeksiyonu (intravital boyama) ile uygulanabilir. Vital boyama ile sitoplazmik yapılar gösterilir. Çekirdek zarı vital boyalara dirençlidir. Çekirdek zarının boyaları geçirmesi hücre ölümünün ifadesidir.

Vital boyama, diğer kesitsel yöntemlerde değerli bir kontrol olarak kullanılabilirler. Canlı hücreler ilk kez Paul Ehrlich tarafından metilen mavisi (1887) ve nötral red (1894) kullanılarak gösterilmiştir.

Koloidal bir boya olan tripan mavisi ile makrofaj sistemine ait hücrelerde fagositoz gösterilebilir. Çini mürekkebi ince bir süspansiyondur ve makrofaj sistemine ait hücrelerde fagositoz gösterilebilir. Janus green ile mitokondri supravital olarak gösterilir.
2-Sitolojik Yöntemler: Hücre içeren sıvılar, aspire kemik iliği gibi ince doku parçaları lam üzerine alınarak tespit edilir. Organların veya dokuların lama sürünmesi ile veya vaginal ve burun sürüntülerinin lama yayılması ile hücrelerin yapısı ortaya konabilir. Boyanmış smearlerin incelenmesi eksfolyatif sitolojide standart yöntemdir. İlk kez Beale (1860) tarafından uygulanmış ve Papanicolaou (1943) tarafından geliştirilmiştir.

Dalak ve kemik iliği gibi organların kesi yüzeyine veya organın bir parçasına lam değdirilerek uygulanan baskı yöntemi (impression yöntemi) ile dokunun yapısı hakkında bilgi edinilebilir. Yumuşak tümörlerde malignite bu teknikle hızlı çalışılabilir.

Smearlerde hücreler canlı hale göre daha büyüktür ve hücresel ayrıntı daha rahat izlenir. Kesitsel tekniklere ek olarak smearler kullanılabilir.
3-Kesitsel Yöntemler: Dokulardan yaklaşık bir hücre kalınlığında kesitler alınarak boyanır. Birçok kesitsel yöntem vardır. Seri kesitlerin alınması ile dokunun üç boyutlu yapısı hakkında bilgi edinilebilir. Tüm örneklerden numaralandırılarak kesit alınır, boyanır ve incelenir. Doku büyük ise belli aralıklarla kesit alınır. Bu yöntem basamaklı kesit alma olarak bilinir.

Taze veya tespit edilmiş dokulardan jilet ile mikrotomsuz kesit alınabilir, boyanabilir. Sadece yüzey boyanacağından histolojik yapı iyi gözlenmez.

Mikrotom kullanarak uygulanan kesitsel yöntemlerde uygun kıvama getirilen dokular parafin, selloidin veya sentetik rezinlere gömülür. Ya da dondurma uygulanabilir. Dondurma kesitler taze dokulardan alındığı için tespit gerekli değildir.

Histolojik kesitler genellikle 4-7 µm kalınlığında alınır. Yağ damlacıkları, sinir lifleri ve kan damarları gibi büyük yapılar için 10-25 µm lik kesitler alınabilir. Rezinlere gömülen dokulardan 1 µm lik kesitler alınabilir. Elektron mikroskopik gözlemler için 50-100 nm’lik çok ince kesitler alınırken eğitim için özel mikrotomlarla 300-400 µm lik çok kalın kesitler de alınabilir.

Dişler, kemik gibi sert dokuların kesit alınmadan önce dekalsifiye edilmeleri gerekir. Matriks bileşeni çalışılacaksa dekalsifiye edilmemiş örnekler dens gömme ortamlarına gömülerek ağır mikrotomlarla kesit alınarak incelenir.

Mikroskobik inceleme için kesitlerin boyanması gerekir. Dokuların renklendirilmesi, renkli boyalar veya floresansı artıran boyalarla, renkli son ürünler oluşturan kimyasal reaksiyonlarla veya ağır metal tuzları dokuya çöktürülerek yapılabilir.

Histolojide floresans immünolojik yöntemler, otoradyografi, mikroinkrenasyon ve mikroradyografik yöntemler de kullanılmaktadır.
Floresans İmmünohistolojik Yöntemler: Florokromla işaretlenmiş antikorlar kullanılır. Çok spesifik bir yöntemdir. İmmün bileşikleri ve dokulardaki yapıları göstermek için kullanılır. Floresans mikroskopta, dokulardaki az miktardaki florokrom bile görülebilir.
Otoradyografi: Radyoaktif bir elementle işaretlenmiş bileşiğin dokularla birleşimi izlenir. Otoradyografide bir fotografik emülsiyondaki gümüş tuzlarını indirgeme özellikleri ile radyoaktif izotop alanları gösterilebilir. Fotografik emülsiyon özel plaklarından çıkarılır ve kesitlere uygulanır. Biyolojik kullanımdaki radyoaktif izotopların yarı ömürleri birkaç saatten yıllara kadar değişebilir. Radyoaktivite ile çalışırken dikkatli olunmalıdır.
Dondurup Kırma (Cryofracture=freeze–fracture–etching): Fiksasyon yapılmaz ya da çok hafif yapılır. Dokular, gliserol ile muamele edilerek likit nitrojende dondurulur. 10^-18 mm Hg ile vakumlanır. Isıtılan metalden çıkan buharla kaplanır. Oda ısısında asit ile tahrip edilir. Böylece geriye metal ile kaplı bir kalıp kalır. TEM’de boyamadan incelenir. En az artifakt oluşturan bir yöntemdir.
Mikroinkrenasyon (yakıp-kül etme): Lam üzerine alınan kesitler elektrikli fırında sıcaklık yavaş yavaş artırılarak yakılır. Organik maddelerin tümü uzaklaştığından geriye dokunun mineral iskeleti kalır. Yansıyan ışık ve karanlık saha mikroskobu ile inkrenasyon yapılmamış kontrol kesitle karşılaştırılarak incelenir. Minerallerin ölçümü de yapılabilir.

Mikroradyografi: X-ışınlarının absorbsiyonu ile dokunun kimyasal yapısı hakkında bilgi edinilir. Bu yöntemle x-ışınlarını absorbe eden kemik, kıkırdak, mine ve dentin gibi hidroksiapatit kristallerini içeren dokular ince taneli fotografik emülsiyon ile yakın tutularak yumuşak x-ışını verilir. Fotografta mineralin dağılımı görülür, miktarları ölçülebilir. Kemik örnekleri 20 kV’lik, yumuşak dokular ise 5-10 kV’lik X-ışınları ile ışınlanır. Yumuşak dokulardaki protein içeriği ve dokunun kuru ağırlığı hakkında bilgi edinilir.
Histokimyasal-Sitokimyasal Yöntemler:

A. İyonların Gösterimi:

• 
  Fe⁺³ iyonları: Perls reaksiyonu ve Prusya mavisi reaksiyonu ile gösterilir.
  

Fe⁺³ + potasyum ferrosiyanid  ferrik ferrosiyanid (koyu mavi)

• 
  PO₄ İyonlarının gösterimi: AgNO₃ ile gösterilir.
  
•