Ari hastaliklari
Yüklə 5,11 Kb. Pdf görüntüsü
|
- Bu səhifədəki naviqasiya:
- Nutrient brouth
- Brain Heart Infusion Agar
- Bal arılarında spor oluşturan bakterilerin farklılıkları
- Paenibacillus larvae seviye testi
Bal Arısı Hastalık ve Zararlıları Distile su 1000 ml pH: 7.0 Bu formülü içeren besi yerinden 28 gram alınarak 1 litre distile su içinde eritilir. 121ºC’de 15 dakika otoklav’da tutulur. 56ºC’ye kadar soğutulur. Steril petrilere dökülür. Bir gece inkubasyonda kontrolde bırakıldıktan sonra kullanılır. Nutrient brouth Meat extract 3.0 g Peptone 5.0 g Distile su 1000 ml pH: 7.0 Bu formulü içeren besi yerinden 13 gram alınarak 1 litre distile su içinde eritilir. Tüplere 5 ml taksim edilir. 121ºC’de 15 dakika otoklav’da tutulur. Bir gece inkubasyonda kontrolde bırakıldıktan sonra kullanılır. Brain Heart Infusion Agar Calf Bransi Infusion from 200.0 g Beef Heart, Infusion from 250.0 g Bacto Proteose Peptone 10.0 g Bacto Dextrose 2.0 g Sodium Chloride 5.0 g Disodium Phosphate 2.5 g Thiamin hidroklorür 0.2 mg Sodium Nitrat 1-2 mg 25ºC’de pH 7.4’e ayarlanır. Bu formülü içeren besi yerinden 37 gram alınarak 1 litre distile su içinde eritilir. 121ºC’de 15 dakika otoklav’da tutulur. 56ºC’ye kadar soğutulur. Steril petrilere dökülür. Bir gece inkubasyonda kontrolde bırakıldıktan sonra kullanılır. Hastalık belirtilerini gösteren 3-5 larva 9 ml steril su içeren vida kapaklı tüp içine konulur. Bu işlem steril pamuk svaplarla yapılır. Alınan örnekler karıştırılarak larvalar iyice parçalanır. Tüp, benmari içerisinde 80ºC’de 10 dakika tutulur. Isıya maruz bırakma işlemi ile sporsuz bakteriler öldürülmektedir. Süspansiyon, steril pamuk svapla yada steril L şekilli yayıcı bir aletle 0.2 ml süspansyon Tiamin ilaveli Brain heart infuzyon agarın yüzeyine eşit şekilde sürülerek 37ºC’de 7 Bal Arısı Hastalık ve Zararlıları 72 saat inkubasyona bırakılır. Koloniler küçük (1-2 mm) çapında ve opaktır. Süspansiyondan çok fazla sayıda Paenibacillus larvae sporu varsa besi yüzeyi kolonilerle kaplanmaktadır. Üreme olmazsa besi yeri 7 gün kadar etüvde bekletilir. Besi yerinde koloni üreyebilmesi için en az 100 Paenibacillus larvae sporu bulunması şarttır. Üreyen bakteri kolonileriyle katalaz, nitrat redüksiyon testleri yapılır. Paenibacillus larvae, nitratı nitrite indirgemektedir. Nitrat redüksiyon testinde kırmızı rengin görülmektedir.Bu nitratın nitrite indirgendiğini kanıtlamaktadır. Brain heart infusyon agarın bir litresine 1-2 mg potasyum nitrat konur. Besi yerinde üreyen bakteri kolonileri üzerine bir damla sulfanilik asit- alpha-naphtol reagenti damlatılır. Şayet nitrat nitrite indirgenmişse kırmızı görülür. Katalaz testi, bakteri kolonisinin üzerine 1 damla %3’lük hidrojen peroksit damlatıldığında Paenibacillus larvae hemen hemen daima negatif reaksiyon vermektedir. Gaz kabarcığı görülmemektedir. Bal arılarında spor oluşturan bakterilerin farklılıkları Türler Brownian hareketi Katalaz üretme Nitrat indirgeme Nutrient agarda üreme Paenibacillus larvae + - + - Paenibacillus alvei - + - + Brevibacillus laterosporus - + + + Paenibacillus pulvifaciens - - + + Paenibacillus larvae seviye testi: Hastalıklı petekten alınan örneklerle spor süspansiyonu hazırlanır. Bu amaçla 10 ml sterl su ile 10 adet hastalıklı larva karıştırılır. Hastalıklı bir larva ortalama 2.5 milyar spor içermektedir. Bu karışımın 1 militresinde 2.5 milyar amerikan yavru çürüklüğü sporu vardır. Süspansiyondan alınarak tiamin ilaveli Brain heart infuzyon agar yüzeyine sürülen 0.2 ml süspansiyonda (0.2=500 milyon spor) bulunmaktadır. Besi yeri 72-96 saat 37ºC’de inkube edilir. Sonuçlar bir hastalıklı larvada ne kadar Paenibacillus larvae sporu olduğunu göstermektedir. 8 Bal Arısı Hastalık ve Zararlıları Besi yerinde 0 koloni varsa = < her bir larvada 100 canlı spordan az var Besi yerinde 1-9 koloni varsa = < her bir larvada 1000 canlı spordan az var Besi yerinde 10-99 koloni varsa = > her bir larvada 10000 canlı spordan fazla var Besi yeri yüzeyi tamamen kolonilerle kaplamışsa = Canlı spor sayısındaki azalma fark edilememektedir. Hastalıklı larvanın besi yerine ekilmesinden sonra üreyen bakteri kolonisine bakılarak, kovandaki Amerikan yavru çürüklüğünün değerlendirilmesi aşağıdaki şekilde yapılmaktadır. Hastalık yok = Spor yok(Bakteri koloni büyümesi yok) Hastalık 1. seviye = Düşük enfeksiyon düzeyi (1-45 bakteri kolonisi) Hastalık 2. seviye = Yüksek enfeksiyon düzeyi (> 45 bakteri kolonisi) Bal :Klasik olarak 1 kısım bal + 9 kısım su karıştırılmaktadır. Süspansiyonun santrifüj edilmesiyle tüpün dibinde sediment oluşur. Sedimentin mikroskopta incelenmesiyle sporlar aranır. Ancak amerikan yavru çürüklüğü sporlarının kesin teşhisi için kültürel tekniklerle çalışılmalıdır. Diğer bir yöntemde 125 ml bal örneği, 250 ml PBS ile karıştırılır. 500 militrelik şişelerde 3000 G’de 45 dakika santrifüj edilir. Üstteki süpernatant dökülür. Yaklaşık 3 ml karışım ayrılır, tüpe konur. Tüp, benmari içerisinde 80ºC’de 10 dakika tutulur. Besi yerlerine ekim yapılarak 37ºde 72 saat inkube edilir. Bal örneği 45ºC’ye ısıtılarak ve sallanarak akışkanlığı artılır. Sporların bal içinde eşit bir şekilde dağılmaları Daha sonra 25 ml bal içinde 10 ml steril su bulunan steril şişeye aktarılır,karıştırılmak suretiyle sulandırılır. 44 ml pora sahip dializ tüpünün bir tarafı bağlanarak sulandırılmış bal dializ tüpüne konur ve öbür ucu da bağlanır. Tüpler 18 saat akan suyun altında tutularak veya yine aynı süre içerisinde 3-4 kez suyu değiştirilmek suretiyle dializ edilir. Dializden sonra içerik 20000 G’de 20 dakika santrifüj edilir. Süpernatant dikkatlice uzaklaştırıldıktan sonra pipetle dipteki kalıntıdan 1 ml alınarak 9 ml su ile vida kapaklı tüp içinde sulandırılır. 9 Yüklə 5,11 Kb. Dostları ilə paylaş:
|