Wolf Prize in Agriculture (1157 Pages)

Ronald L. Phillips

979

Eleven of 14 (80%) middle repetitive sequences (class 10–100

copies) are also maize-specific. Two among the remaining

three showed only faint cross-hybridization to oat genomic

DNA. Highly repetitive sequences were preselected in this

study, and the process of selection showed that most highly

repetitive maize sequences are also maize-specific (Fig. 4 b–d).

DISCUSSION

Maize Species-Specific Sequences.

The cross between oat

and maize, two species from different subfamilies of the

Graminae, represents the widest combination of crop species

to date yielding stable, fertile partial hybrids (37). However,

little is known about the comparative structure and composi-

tion of the two genomes. Highly conserved sequences such as

rRNA genes or tubulin cDNAs cross-hybridize to correspond-

ing genes in the maize and oat genomes. Unique maize RFLP

probes also have been used to detect sequences in the oat

genome (9). A series of cDNA probes has shown 71% con-

servation of linkage associations between maize and oat

according to Van Deynze et al. (38); however, almost 50% of

maize PstI unique genomic probes do not hybridize to oat

genomic DNA under standard conditions (39).

We report herein that the proportion of maize and oat

nucleotide sequences that cross-hybridize to each other is low

under standard hybridization conditions (65

ЊC, 6ϫ SCC).

Among the set of low-copy-number sequences isolated and

tested, more than 50% appeared to be maize specific. The

proportion of maize-specific sequences among the middle or

highly repetitive maize elements was about 80–95% and

among those that do hybridize to oat, most hybridize only

weakly; therefore, even total genomic DNA of maize can serve

as an efficient probe to identify maize-specific cosmids in an

oat genomic background. But total maize DNA is less reliable

for this use than the described multiprobe because it gives

more false positive clones during primary screening of the

cosmid library. The oat–maize chromosome addition lines are

especially attractive as a source for isolation of region-specific

maize DNA fragments. It is possible to identify even small

portions of a maize chromosome in an oat genome by probing

with total maize genomic DNA, a multiprobe of maize re-

peated nucleotide sequences, or many other types of cloned

maize sequences. In the case of the highly conserved nucleo-

tide sequences, which are common in both maize and oat

genomes, RFLPs may be used to differentially identify maize

DNA in the oat genome.

Efficiency of Recovering Maize-Specific Cosmid Clones.

The efficiency of identifying maize-specific cosmid clones

depends on copy number and the pattern of distribution of

repeated sequences chosen to comprise the multiprobe. Stud-

ies of genome structure in maize (28, 40), especially analysis of

repeated DNA sequences around several maize genes (30, 31),

show that unique sequences with a median size of 2.1 kb are

surrounded by a long, complex array of repeated sequences

that belong to many different families, many of which appear

to be of retrotransposon origin (31).

Our multiprobe highlighted EcoRI subfragments in each of

the 29 cosmid clones of chromosome 9 analyzed, detecting

about 100 of the total of more than 200 fragments. Each clone

contained one or more of the repeated sequences present in

the multiprobe. The same group of EcoRI fragments were

classified as highly repetitive nucleotide sequences because

they showed strong hybridization to labeled total maize

genomic DNA. In the same set of clones at least 50 additional

EcoRI fragments showed a strong hybridization signal to

maize genomic DNA and may be classified as additional highly

repetitive nucleotide sequences. These additional sequences

could be included in our collection of maize-specific repeated

nucleotide sequences to increase the efficiency of the multi-

probe used in searching for maize-specific cosmids.

The number and diversity of repeats differ among clones.

Some of the cosmids consist entirely of several different

repeated sequences; others have only one copy of the tested

repeats. Regions of maize chromosomal DNA consisting only

of low-copy-number sequences with a composite length ex-

ceeding 40 kb, the size of the DNA insertion in most cosmids,

would not be detected in a cosmid library by screening with the

multiprobe.

Because the 29 analyzed clones of maize chromosome 9 were

selected with the help of the multiprobe, they may carry more

repeated DNA sequences than a random set of clones. There-

fore, a control experiment was conducted to analyze the

distribution of repetitive sequences in a set of 38 cosmid clones

randomly chosen from a cosmid library constructed from

DNA of the parental maize line Seneca 60. Only 2 of 38 maize

cosmid clones revealed cross-hybridization to oat genomic

DNA, and they were found to be composed of rDNA se-

quences. Thirty-four of the remaining 36 cosmid clones carried

maize-specific highly repetitive sequences detected by the

multiprobe (data not shown). This experiment indicates that

the probability of recovering maize-specific cosmid clones in a

genomic library of maize chromosome 9 with the help of the

primary multiprobe is around 95%.

Oat as a Host for Cloning Large Maize Chromosomal DNA

Fragments.

Impressive achievements have been made in clon-

ing large (

Ͼ1 Mb) DNA fragments in yeast artificial chromo-

somes (41). However, the difficulties encountered make this

method of cloning a eukaryotic genome expensive and prob-

lematic for wide use. Radiation hybrids (derivative cell lines

from irradiated somatic cell hybrids) are an attractive alter-

native for cloning subfragments of a chromosome. Irradiation

to produce chromosome breakage and segregation of genetic

material has been applied to a number of mammalian somatic

cell hybrids containing individual alien chromosomes (10). A

disadvantage of this approach in some cases is that a host

genome and an alien chromosome have too many in-common

nucleotide sequences, thus making difficult the direct analysis,

identification, and isolation of the alien chromosome frag-

ments.

The results of the research reported here allow us to propose

the use of oat as a host for cloning maize genomic DNA. The

substantial differences in the repetitive DNA composition of

oat and maize genomes and the high level of genetic stability

of the maize-addition chromosomes make it possible to apply

conventional molecular methods to the study of maize genetic

material directly in the oat genome. This approach would be

modeled after that used in mammalian systems (10). Radiation

would be used to induce translocations of maize segments into

the oat genome, from which maize DNA could subsequently be

isolated. In comparison with other possible maize-cloning

systems using phages, bacteria, or yeast, the advantage of this

approach is that all maize chromosome fragments will derive

from a known chromosome. The high proportion of maize

sequences that may serve as maize-specific DNA probes in this

system allows the identification of almost any maize chromo-

some segment in oat or any cloned maize DNA fragment in a

library. The current availability of an extensive collection of

mapped DNA markers for all maize chromosomes (42) may

allow us to identify the boundaries of cloned subfragments and

to generate a collection of overlapping subfragments repre-

senting the whole chromosome. This approach would allow the

cloning in oat of subfragments of maize chromosomes of a

wide size range. Chromosomal subfragments 5–30 Mb in size

may be considered optimal because they can be aligned relative

to the genetic map and, if cloned in bacterial artificial chro-

mosomes or even in cosmid vectors, may be arranged in contigs

to generate detailed physical maps for each subfragment.

Thus, 10–60 subchromosomal fragments may comprise a

collection of overlapping large DNA fragments of one partic-

ular maize chromosome. Taking into account the high stability

3528

Agricultural Sciences: Ananiev et al.

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997)

38_2006-7 Phillips.p65

06-Mar-09, 7:49 PM

979

---