Wolf Prize in Agriculture (1157 Pages)

976

Wolf Prize in Agriculture

inserts from only maize chromosome 9 was isolated and

characterized. Based on the large difference in nucleotide

sequence composition between oat and maize and the means

to efficiently isolate and identify maize DNA fragments from

a chromosome addition line, we propose oat as an effective

host for the cloning of maize DNA segments to construct

physical maps for maize chromosomes.

MATERIALS AND METHODS

Maize and Oat Strains.

Oat–maize disomic addition lines

for maize chromosomes 2, 3, 4, 7, and 9 were derived from

plants recovered following sexual crosses of oat by maize (8, 9).

In these crosses about one-third of the recovered plants

contained a haploid set of 21 oat chromosomes plus one or

more maize chromosomes as a result of incomplete maize-

chromosome elimination during early embryo development.

Partial self-fertility due to the production of unreduced ga-

metes by these plants yielded disomic maize-chromosome-

addition oat plants (2n

ϭ 42 ϩ 2). The presence of maize

chromosomes was verified cytologically for each plant in the

current study. The chromosome addition lines, the maize

parent lines Seneca 60 and A188, and the oat parent lines

Starter-1 and Sun II were used for DNA extraction.

Isolation and Analysis of DNA.

Leaves of 2- to 4-week-old

seedlings grown in a growth chamber were used for nuclei

isolation in pH 9.5 buffer according to the protocol of Liu and

Whitter (32). High molecular weight DNA was purified by

phenol extraction from nuclei after lysis of the nuclei suspen-

sion in an equal volume of the same buffer supplemented with

2% sarkosyl. After two phenol extractions, DNA was precip-

itated with two volumes of ethanol in the presence of 0.3 M

NaOAc, dissolved in TE buffer (10 mM Tris

⅐Cl͞1 mM EDTA,

pH 8.0), treated with RNase (50 mg

͞ml), and extracted with

phenol-chloroform.

Sau3A genomic DNA fragments were cloned into the

BamHI site of dephosphorylated plasmid vector pBlueScript

(pBS) II KS (Stratagene). EcoRI subfragments from cosmid

clones were cloned into the EcoRI site of the dephosphory-

lated pBS KS vector according to standard procedures (33).

Insertions were amplified with the help of forward and reverse

primers (Stratagene) and purified by agarose gel electrophore-

sis.

Gel-blot analysis of plant and cosmid DNA was carried out

as described by Sambrook et al. (33) with several modifications

(34). DNA fragments and total plant DNA were labeled by

random primer extension (35).

Seventeen clones carrying maize repetitive nucleotide se-

quences (30) were kindly provided by J. Bennetzen (Purdue

University, West Lafayette, IN). A clone containing the maize

185-bp knob repeat (36) was provided by W. Peacock (Com-

monwealth Scientific and Industrial Research Organization,

Canberra, Australia).

Cosmid Library Construction and Screening.

Cosmid li-

brary construction and screening were done using the cosmid

vector SuperCos 1 (Stratagene) and packaging extract Giga-

Pack II (Stratagene) with protocols provided by the manufac-

turer. Total nuclear DNA was partially digested with Sau3A,

dephosphorylated, and ligated to the cosmid vector. Ligation

products were packaged and the library propagated in Esch-

erichia coli XL1-Blue MR. Cosmid libraries were constructed

for genomic DNAs of the parental maize (Seneca 60) and oat

(Starter-1) lines, as well as for the oat–maize chromosome 9

addition line.

The size of the insertion in a cosmid clone was determined

as the sum of EcoRI subfragments after fractionation in gels

with different concentrations of agarose from 0.6% up to 1.5%

to achieve satisfactory resolution of long and short DNA

subfragments.

RESULTS

Cloning of Maize-Specific Repetitive Sequences.

When la-

beled maize total genomic DNA was used as a probe in blot

hybridization, little cross-hybridization to oat genomic DNA

occurred under standard conditions (65

ЊC in 6ϫ SSC) in

comparison with strong hybridization to maize genomic DNA

(data not shown). This hybridization pattern indicated that a

significant portion of the repeated nucleotide sequences of

maize and oat are not shared. To isolate maize repeated DNA

sequences specific to maize relative to oat (hereafter referred

to simply as ‘‘maize-specific’’ sequences) a maize plasmid

genomic library was constructed with fragments from a com-

plete Sau3A digest and screened with labeled total maize

DNA. Clones were isolated that gave a high signal with total

labeled maize DNA as the probe. Labeled oat genomic DNA

hybridized only to a small extent to the same set of clones on

a replica filter. Purified plasmids with Sau3A insertions,

together with a group of maize repetitive DNA sequences in

plasmids (see Materials and Methods), were cut with appro-

priate restriction enzymes to release insertions. They were

screened by blot hybridization with labeled maize and oat

DNA. Clones showing a high signal similar to the signal of an

18S–26S rDNA sequence were considered as highly repetitive.

From this screening, 15 plasmids from the Sau3A maize

genomic library, 6 Zpr clones (from Bennetzen), and the one

185-bp knob repeat clone were selected as highly repetitive

maize-specific nucleotide sequences. Insertions from these 22

selected plasmids were combined to form a composite multi-

probe. This multiprobe revealed very strong hybridization to

maize genomic DNA on a Southern blot and no detectable

hybridization to oat genomic DNA (Fig. 1). The same multi-

probe was used to screen cosmid partial libraries of genomic

DNA of maize and oat (about 10,000 clones each). Almost all

colonies (90–95%) in the maize cosmid library revealed strong

or moderate signals. At the same time, only a few colonies, all

with relatively weak signals, were detected in the oat cosmid

library. Taken together, these results indicate that this com-

posite multiprobe is highly specific for maize DNA and is

suitable for detecting maize DNA fragments in a cosmid

library made from an oat–maize chromosome-addition line.

Isolation of Maize-Specific Cosmids from an Oat–Maize

Addition-Line Cosmid Library.

The multiprobe was used to

screen a cosmid library made from an oat–maize chromosome

addition line carrying maize chromosome 9. The screening and

rescreening of about 5,000 clones led to the isolation of 29

hybridization-positive individual colonies. The resulting clones

constituted a maize chromosome 9 library. The cloned maize

DNA fragments in the selected 29 clones had a median size of

about 39 kb. Together they comprised more than 1 Mb of

maize genomic DNA. EcoRI restriction enzyme digestion

enabled cutting out the cloned DNA fragments from the vector

and identification of the number and size of EcoRI subfrag-

ments in the original insertions (Fig. 2a). Fractionation of the

samples on gels of various agarose concentrations from 0.6 to

1.5% enabled detection of doublets and additional small

subfragments below 0.5 kb not detected in the 0.8% agarose gel

blots shown.

Blot hybridization of labeled oat genomic DNA to purified

DNA recovered from each cosmid clone cut by EcoRI did not

reveal strong cross-hybridization to any of the EcoRI subfrag-

ments (data not shown). Only after substantial overexposure

were weak signals revealed and then only for a portion of the

DNA fragments. At the same time, most (

Ͼ90%) of the EcoRI

fragments revealed strong, medium, or weak hybridization to

labeled maize genomic DNA (Fig. 2b). The difference in

hybridization to oat vs. maize genomic DNA indicates that the

selected cloned DNA fragments likely originated from the

maize chromosome, with no evidence that any were chimeric

in origin.

Agricultural Sciences: Ananiev et al.

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997)

3525

38_2006-7 Phillips.p65

06-Mar-09, 7:49 PM

976

---