Wolf Prize in Agriculture (1157 Pages)

Ronald L. Phillips

977

The EcoRI digests of the set of selected cosmid clones were

hybridized with the maize-specific repeated-sequence multi-

probe that was used to screen the cosmid library (Fig. 2c). The

multiprobe highlighted about 100 of the more than 200 EcoRI

fragments identified in this set of cosmid clones. On average

about three fragments per cosmid were homologous to various

repeated DNA sequences present in the multiprobe. At the

same time a portion of the EcoRI fragments did not hybridize

to the multiprobe nor to total oat DNA but did hybridize to

labeled total maize DNA. These fragments may be added to

the collection of maize-specific repeated DNA sequences to

make the multiprobe an even more efficient screening tool.

Maize-Specific Clones Originate from Maize Chromosome

9.

EcoRI subfragments that showed no readily detectable

hybridization to maize genomic DNA as the probe were

identified in 12 of the 29 cosmid clones. Presumably they are

low copy number or unique nucleotide sequences. Altogether

they comprise 11% of the EcoRI fragments or about 6.5% of

the total amount of maize DNA cloned in this set of cosmid

clones. Twenty-one of them were recloned in plasmids and, as

illustrated for five fragments in Fig. 3, used as probes on blot

panels of DNA samples from addition lines for maize chro-

mosomes 2, 3, 4, 7, and 9. Two parental maize and two parental

oat lines were also on this blot panel (Fig. 3). Nine of these 21

EcoRI fragments revealed one or several bands with DNA

specific for chromosome 9 of maize and did not hybridize to the

DNA of the other four maize chromosomes tested (Fig. 3 a–c).

Seven of these nine fragments revealed restriction fragment

length polymorphism (RFLP) in the two maize stocks, A188

and Seneca 60 (Fig. 3 a and b). Another 11 EcoRI fragments

produced multiple bands with DNA of all maize chromosomes

tested, which is characteristic for low-copy-number families of

dispersed repeated sequences (10–100 copies) (Fig. 3 d and e).

Eight of these sequences produced a chromosome-specific

pattern of hybridization and potentially could be used for

chromosome identification (Fig. 3 d and e).

Several EcoRI fragments belonging to medium and highly

repetitive classes of nucleotide sequences from different cos-

mid clones of maize chromosome 9 were used as probes. These

revealed a complex pattern of hybridization for all maize

chromosomes on the panel of chromosome-addition lines (Fig.

4b). Labeled highly repetitive DNA from cosmid 1 (Fig. 4c), as

well as the full set of 29 cosmids (data not shown), gave strong

hybridization to all maize chromosomes and did not reveal any

chromosome 9-specific repetitive nucleotide sequences. Only

the 185-bp knob-repeat revealed apparent chromosome spec-

ificity (Fig. 4d). Many copies of 185-bp repeats are located on

chromosome 9, and a small fraction is present on chromosome

4 in these materials. Several weak bands are seen with DNA of

maize chromosomes 2 and 3. This result is compatible with

reports that most 185-bp knob DNA sequences are organized

in the form of clusters on different chromosomes and relative

knob size can differ greatly among chromosomes in different

maize lines (31).

F

IG

. 1.

Blot hybridization of a labeled multiprobe, composed of 22

maize-specific repetitive DNA sequences, to genomic DNA digests of

2 maize and 2 oat varieties. Strong signal is seen over lanes with maize

DNA but not those with oat DNA. (a) EtdBr-stained 0.8% agarose gel

after separation of DNA samples cut with EcoRI. (b) Autoradiogram

after hybridization to the P-32 labeled multiprobe.

F

IG

. 2.

Blot panel of 29 maize-specific cosmid clones isolated from

a cosmid library of an oat–maize chromosome 9 addition line. (a)

Cosmids (1–29) are cut by EcoRI restriction enzyme and size-

fractionated in an 0.85% agarose gel stained with EtdBr (M

ϭ

molecular weight marker, 1-kb ladder). (b) Labeled, total genomic

maize DNA as a probe shows strong, medium, or weak hybridization

to almost 90% of all EcoRI subfragments present in the cosmid clones.

(c) Labeled multiprobe of highly repeated maize DNA sequences

shows hybridization to from one to five EcoRI fragments in each lane.

3526

Agricultural Sciences: Ananiev et al.

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997)

38_2006-7 Phillips.p65

06-Mar-09, 7:49 PM

977

---

978

Wolf Prize in Agriculture

Most Cloned Maize Nucleotide Sequences Are Maize-

Specific.

Seven out of 11 unique or low-copy-number se-

quences showed no cross-hybridization to oat genomic DNA

(Fig. 3 a–d). This result indicates that a significant portion

(

Ͼ50%) of low-copy-number maize sequences have diverged

enough to show no cross-hybridization to oat genomic DNA.

F

IG

. 4.

Hybridization of medium and highly repetitive cloned maize DNA sequences to a blot panel of oat–maize chromosome addition lines

carrying maize chromosomes 9, 7, 4, 3, and 2, respectively; m1 and m2 are maize stocks A188 and Seneca 60; o1 and o2 are oat stocks Sun II and

Starter-1. (a) EtdBr-stained 0.8% agarose gel; lane M is a 1-kb molecular weight marker ladder. (b) The 0.7-kb EcoRI fragment of cosmid 10 shows

multiple bands on different maize chromosomes as well as one common band for all chromosomes. (c) Cosmid 1, with a 40-kb insertion, shows

strong hybridization signal over maize (lines m1 and m2) and over chromosome addition lines 9, 7, 4, 3, and 2; no hybridization is seen over oat

DNA (lines o1 and o2). (d) With the 185-bp knob repeat, most of the hybridization signal is located on chromosome 9. No hybridization to oat

DNA is detected.

F

IG

. 3.

Hybridization of unique and low-copy-number DNA sequences isolated from maize-specific cosmids shown in Fig. 2 to a blot panel of

oat–maize chromosome addition lines carrying maize chromosomes 9, 7, 4, 3, and 2, respectively; m1 and m2 are maize stocks A188 and Seneca

60; o1 and o2 are oat stocks Sun II and Starter-1. (a) The 2.5-kb EcoRI fragment from cosmid 15 shows one band on the chromosome 9 addition

line. An additional polymorphic band is present in the parental stocks of maize. (b) The 1.8-kb EcoRI fragment from cosmid 28 detects two bands.

One band, polymorphic between m1 and m2, is present in the chromosome 9 addition line. An additional nonpolymorphic band is present on

chromosome 9 and in both parental stocks. (c) The 2.1-kb EcoRI fragment from cosmid 10 shows one band on chromosome 9. (d) The 1.4-kb EcoRI

fragment from cosmid 20 detects about 20 bands in parental maize stocks and several bands among the chromosome addition lines. The band pattern

is chromosome-specific. No cross-hybridization occurred to oat DNA in a–d. (e) The 2.9-kb EcoRI fragment from cosmid 6 detects several

polymorphic bands in parental maize stocks. One nonpolymorphic band is seen in maize, oat, and chromosomes 9, 7, 4, and 2 addition lines.

Additional bands are seen in other chromosome addition lines.

Agricultural Sciences: Ananiev et al.

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997)

3527

38_2006-7 Phillips.p65

06-Mar-09, 7:49 PM

978

---