Wolf Prize in Agriculture (1157 Pages)

982

Wolf Prize in Agriculture

(Zea mays L.) lines Seneca 60, A188, A619, B73, Mo17, the

(A188

ϫ W64A)F

1

hybrid, and a line carrying the allele bz1-

mum9. More than 200 putative F

1

-hybrid plants indicating

successful (oat

ϫ maize) hybridization were recovered and

analyzed for vigor, seed set, maize chromosome retention in

various tissues, and maize chromosome transmission to F

2

offspring (5, 10). F

2

plants were tested by PCR-based markers,

test crosses, genomic in situ hybridization (GISH), and chromo-

some counting for presence, stability, and transmission of maize

chromosomes added to the oat genome (15). F

2

plants were

propagated for production of F

3

and subsequent generations.

Backcross (BC

1

) plants monosomic for the maize chromosome

addition were produced by crossing disomic oat–maize chromo-

some addition plants back to their corresponding parental oat

lines. Batches of 150–300 BC

1

seeds were irradiated with

␥ rays

from a

137

Cs source at different intensities (20–50 krad) to

induce as many maize chromosome breaks as possible without

seriously damaging the vigor of the seeds or resulting seedlings.

BC

1

F

2

offspring with transmitted maize chromosome deficien-

cies or oat–maize chromosome translocations (RH plants) were

selected by a PCR assay with primers specific for Grande 1 (16)

and CentA (17) and used for physically mapping molecular

markers to the particular maize chromosome segments.

Genomic DNA Extraction.

For a limited number of PCRs (75 or

fewer) from single plants, DNA was extracted by the use of the

REDExtract-N-Amp Plant PCR kit (Sigma). For larger numbers

of PCRs (

Ͼ75) from single plants, DNA was extracted by using

either the DNeasy Plant Mini kit (Qiagen, Valencia, CA) or the

acetyltrimethylammonium bromide procedure (18). For labeling

and use as probe in GISH experiments, genomic maize DNA was

extracted from leaf cell nuclei and purified through a CsCl

gradient (19).

PCR.

PCRs were accomplished by the use of the REDExtract-

N-Amp Plant PCR kit, according to the vendor’s recommenda-

tions. F

1

plantlets and seedlings of the consecutive generations

were screened for the presence of maize sequences by using

maize-specific primers for the long terminal repeat of the highly

dispersed retrotransposon Grande 1 (16) and for the highly

centromere-specific retrotransposon-like repeat CentA (17).

Individual maize chromosomes or chromosome segments in F

1

plantlets, addition lines, and RH seedlings were identified by

using maize-specific primers for simple-sequence repeat (SSR)

markers (10) that were selected from the maize genetics and

genomics database (www.maizegdb.org). BC

1

F

2

plants (putative

RH plants) were tested for presence vs. absence of maize

chromosome segments by a PCR assay with 45 SSR markers

specific for maize chromosome 1 (p-umc1354 to p-umc2244

spanning 1,120 map units, according to the IBM2 map). Markers

were selected from the maize genetics and genomics database

mentioned above.

Cytology.

Root tips (1.5–2 cm) of oat, maize, and oat–maize

chromosome addition and RH lines were pretreated, fixed, and

stored as described in ref. 10. Root tips for chromosome counting

were prepared as described in ref. 20. Meristem cells were

squashed in 2% wt

͞vol Aceto-Orcein (Carolina Biological Sup-

ply). Root tips for GISH were prepared as described in ref. 10.

Further steps of RNase treatment, postfixation, and in situ

hybridization were as described earlier in ref. 21 except that total

genomic maize DNA was labeled by the use of the ULYSIS

Alexa Fluor 488 nucleic acid labeling kit (Molecular Probes) and

probed on slides without using unlabeled competitor DNA.

Hybridization was carried out in 40% formamide in 1.5

ϫ SSC

(225 mM NaCl

͞22.5 mM trisodium citrate, pH 7.0) at 37°C.

Posthybridization stringency washes were carried out in 40%

formamide in 1.5

ϫ SSC at 42°C. Chromosomes were counter-

stained with propidium iodide. Signals were visualized and

captured by using an Axioskop microscope equipped for epi-

fluorescence (Zeiss) and a Magnafire charge-coupled device

camera (Optronics International, Chelmsford, MA).

Results and Discussion

Maize Chromosome Elimination in (Oat

؋ Maize)F

1

Hybrids.

In oat

ϫ

maize crosses, maize chromosomes are occasionally retained (2).

This situation is distinct in that the maize genome is completely

eliminated in hybridizations between maize and wheat or barley.

There is only one report of a maize chromosome being retained

in wheat; however, the maize chromosome was not transmitted

to offspring (23). The timing of elimination differs as well. The

maize chromosome elimination process in oat sometimes ex-

tends over longer periods of time compared with that in F

1

hybrids generated from wheat

ϫ maize and barley ϫ maize

crosses (24). In 70% of (wheat

ϫ maize)F

1

embryos, one or more

maize chromosomes were eliminated at the first mitosis. By the

eight-cell stage, the embryos had lost all maize chromosomes

(24). Maize chromosome elimination from (oat

ϫ maize)F

1

embryos starts at an early stage in embryogenesis as well (4).

However, as an example of the extended time of maize chro-

mosome elimination from oat, in the (oat

ϫ maize)F

1

plant

F

1

-5133-1 with maize chromosomes 4, 7, and 10 all detected at

a young plant stage, a consecutive elimination of individual

maize chromosomes was detected by the PCR analysis of

genomic DNA extracted from tissues of flag leaves of different

tillers from the same plant shortly after meiosis. The first tiller

retained only maize chromosome 4, thus eliminated chromo-

somes 7 and 10. The second tiller eliminated chromosome 10,

thus retained chromosomes 4 and 7. The third and fourth tillers

eliminated chromosome 7, thus retained chromosome 4 and

chromosome 10 as a short-arm telosome (Fig. 1). We observed

further instances where maize chromosomes were lost in later

growth stages, particularly from plantlets with two or more

originally retained maize chromosomes in their complements

(results not shown).

(Oat

؋ Maize)F

1

Hybrids and F

2

Offspring in Different Genetic Back-

grounds.

Our initial work was conducted with the maize chro-

mosome donor Seneca 60 and the oat recipient Starter. In the

last 2 years we have tested several other combinations of maize

and oat lines. A total of 201 (oat

ϫ maize)F

1

plants have been

generated from various maize and oat backgrounds, of which 68

F

1

hybrids retained one or more maize chromosome(s) in their

complements. All 10 maize chromosomes could be recovered,

with each occurring at different frequencies as single additions

and in combination with other maize chromosomes. No obvious

preferential combination for two or more specific maize chro-

mosomes was detected in multiple additions in haploid oats. The

frequency of recovery of a particular maize chromosome, the

Fig. 1.

PCR products from DNA of the F

1

(Starter

ϫ B73) plant F

1

-5133-1 when

chromosome-specific SSR markers are used; electrophoresis in a 3.5% agarose

gel shows the different elimination of maize chromosomes in individual tillers.

Lanes 1, young plantlet; lanes 2, tiller F

1

-5133-1

͞a; lanes 3, tiller F

1

-5133-1

͞b;

lanes 4, tiller F

1

-5133-1

͞c; lanes 5, tiller F

1

-5133-1

͞d; and lane M, standard

100-bp ladder.

9922

͉ www.pnas.org͞cgi͞doi͞10.1073͞pnas.0403421101

Kynast et al.

38_2006-7 Phillips.p65

06-Mar-09, 7:49 PM

982

---