The mechanism of peptide exchange by mhc II molecules

XIII 
Table of contents 
2.3.1
 
Preparing and crystallizing HLA-DR2/MBP in the presence of J10-1 or J10-12 ......... 28
 
2.3.2
 
Preparing and characterizing 
15
N-labeled MBP peptide ................................................ 29
 
2.3.3
 
Preparing the complex of HLA-DR2 and 
15
N-labeled MBP peptide ............................ 31
 
2.3.4
 
Measuring 
1
H-
15
N HSQC spectra of 
15
N-labeled MBP peptide free in solution and in 
complex with HLA-DR2 ............................................................................................... 31
 
2.3.5
 
Deuterating MBP peptide to improve signal intensity of the HSQC spectrum of isotope 
labeled MBP peptide in complex with HLA-DR2 ........................................................ 35
 
2.3.6
 
Measuring and comparing HSQC spectra of HLA-DR2/
15
N,
13
C,
2
H-MBP before and 
after addition of J10-1 ................................................................................................... 36
 
2.3.7
 
Performing HNCA and 
15
N-NOESY experiments of HLA-DR2/
15
N,
13
C,
2
H-MBP to 
determine resonance assignments ................................................................................. 39
 
2.3.8
 
Measuring 
19
F-NMR spectra of J10-11 in the presence of HLA-DR2/MBP and HLA-
DR2/CLIP ..................................................................................................................... 40
 
2.4
 
Conclusion ............................................................................................................ 42
 
3  Chapter II: Structural effects of destabilizing peptide-MHC II interactions and 
implications for the peptide exchange mechanism of HLA-DM ......................... 46 
3.1
 
Introduction ......................................................................................................... 46
 
3.2
 
Materials and Methods ....................................................................................... 47
 
3.2.1
 
Preparation of biotinylated HLA-DM and HLA-DM mutant ........................................ 47
 
3.2.2
 
Preparation of HLA-DM used for crystallization .......................................................... 48
 
3.2.3
 
Preparation of covalently linked HLA-DR1/peptide complexes and of HLA-DR1 
mutant ............................................................................................................................ 48
 
3.2.4
 
Preparation of HLA-DM with an N-terminally truncated α chain ................................ 49
 
3.2.5
 
Surface plasmon resonance experiments ....................................................................... 49
 
3.2.6
 
Protein crystallization, collection of diffraction data and structure solving .................. 50
 
3.2.7
 
Eluting covalently linked peptide from HLA-DR1 ....................................................... 51
 
3.2.8
 
Mass spectrometry ........................................................................................................ 51
 
3.3
 
Results and discussion ......................................................................................... 51
 
3.3.1
 
Preparing HLA-DM and HLA-DR1 carrying a truncated HA peptide, both used for 
crystallization experiments ............................................................................................ 51
 
3.3.2
 
Measuring pH-dependent affinity of HLA-DM to HLA-DR1 carrying an N-terminally 
truncated HA peptide using surface plasmon resonance ............................................... 53
 
3.3.3
 
Crystallizing HLA-DR1 carrying a truncated HA peptide, in the presence of HLA-DM 
and alone ....................................................................................................................... 55
 
3.3.4
 
Solving the structure of HLA-DR1 carrying an N-terminally truncated HA peptide .... 56
 
3.3.5
 
Structure of HLA-DR1 carrying an N-terminally truncated HA peptide ...................... 57
 
3.3.6
 
Eluting N-terminally truncated HA peptide from HLA-DR1 protein used for 
crystallization and analyzing by mass spectrometry ..................................................... 65
 

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XIV 
Table of contents 
3.3.7
 
Measuring HLA-DR binding to N-terminally truncated HLA-DM using surface 
plasmon resonance ........................................................................................................ 67
 
3.3.8
 
Measuring HLA-DM binding to HLA-DR1 carrying an HA peptide variant with a 
valine at P1 position and two N-terminal peptide residues absent ................................ 68
 
3.3.9
 
Measuring HLA-DM binding to HLA-DR1 mutant (Valß85Asp) using surface plasmon 
resonance ....................................................................................................................... 69
 
3.4
 
Conclusion ............................................................................................................ 71
 
4  Chapter III: Investigating HLA-DM binding to high-affinity MHC II/peptide 
complexes ............................................................................................................... 74 
4.1
 
Introduction ......................................................................................................... 74
 
4.2
 
Materials and Methods ....................................................................................... 75
 
4.2.1
 
Preparation of HLA-DR/peptide complexes ................................................................. 75
 
4.2.2
 
Surface plasmon resonance experiments ....................................................................... 76
 
4.2.3
 
Fluorescence polarization experiments ......................................................................... 76
 
4.3
 
Results and discussion ......................................................................................... 76
 
4.3.1
 
Preparing the high-affinity complexes HLA-DR2/MBP and HLA-DR1/HA ............... 76
 
4.3.2
 
Measuring HLA-DM binding to HLA-DR2/MBP and HLA-DR1/HA using surface 
plasmon resonance ........................................................................................................ 77
 
4.3.3
 
Comparing HLA-DM binding detected by surface plasmon resonance with HLA-DM 
catalysis measured by fluorescence polarization ........................................................... 78
 
4.4
 
Conclusion ............................................................................................................ 79
 
5 
Final discussion and outlook............................................................................. 80 
6 
References .......................................................................................................... 84 

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