Sedat turgut

2.6. Fluniksin meglumine
Nikotinik asit türevi NSAİİ bir ilaç olan fluniksin megluminin aneljezik, antipiretik ve inflamasyon önleyici etkileri vardır. Aneljezik etkisini, duyarlı ağrı reseptörlerini mekanik ya da kimyasal yolla uyaran maddeleri bloke edip prostoglandin sentezini durdurarak ağrı impulslarını bloke etmesi ile sağlar. COX enzimini inhibisyonu sonucunda prostoglandin sentezi durmakta ve bu durum lokal yangı mediatörlerini inhibe ederek yangı önleyici etki şekillenmektedir. Septik şokta da ilacın tesirli olduğu belirtilmektedir (Karol, 2002). Fluniksin meglumin çeşitli hayvan türlerinde genel olarak hipertermide, iskelet-kas sistemi inflamasyonunda. endotoksemi ile ilişkili yangılarda, iç organlarda düz kas kasılmaları sonucu ortaya çıkan ağrılarda ve septisemide kullanılmaktadır (Karol, 2002; Langston 2004). Fluniksin megluminin endotoksik şokta kan ve dokulardaki laktik asit miktarını azaltarak kan basıncının düşmesine engel olup kalbe venöz dönüşü iyileştirdiği ve damar endotel hücrelerindeki tahribatı azalttığı tespit edilmiştir (Karol, 2000). 2,0 mg/kg dozda intramüsküler olarak uygulanan fluniksin megluminin yarılanma ömrüu yaklaşık olarak üç saat olduğu tespit edilmiştir (Welsh ve ark, 1993). Bu ilaç köpeklere 0,5-2,2 mg/kg dozda intramüsküler ya da intravenöz yolla günde bir kez en fazla üç gün uygulanır (Karol, 2002). Diğer nonsteroidal antiinflamatuar ilaçlar ve steroidler ile birlikte kullanıldığında kontrendikasyon olarak gastrointestinal ülser ya da kanamalar şekillenebileceği için birlikte kullanılmamalıdırlar (Langston, 2004). Kanama bozukluğu olup NSAİİ’ lere duyarlılığı olan hayvanlar ile (Von Willebrand hastalığı, hemofili, karaciğer yetmezliği, rodentisid toksikasyonu) astım, böbrek yetmezliği ve gastrointestinal ülserasyonu olan hayvanlarda kullanılmamalıdırlar. İlaçlar karaciğerde metabolize olduktan sonra böbrekler aracılığı ile atıldığı için bu organlarda fonksiyon bozukluğu olan hayvanlarda dikkatli kullanılması gerekmektedir (Langston, 2004; Monteiro-Steagall ve ark, 2013).
2.7. Hemostazis
Hemostazis, kan kaybının durdurulması anlamına gelmektedir. Hemostazis; bir damar zedelendiği zaman çeşitli mekanizmalar ile sağlanmaktadır. Bu mekanizmalar; damar spazmı, trombosit tıkacı oluşumu, kanın koagülasyonu sonucu kan pıhtısı oluşumu, fibröz dokunun pıhtı içine doğru büyümesiyle damardaki deliğin kalıcı olarak kapatılmasıdır (Turgut, 2000).

Primer hemostasis primer trombosit plağı oluşturmakta sorumlu evredir. Burada tepkiler vasküler endothelium bileşenleri, trombositler ve von Willebrand faktörü ile (vWf) meydana gelir. Normal vasküler endotelyum NO ve PGI2 dahil trombosit etkinleşmesinin antagonistlerinin sentezi tarafından olan koagülasyon sürecini engeller. Fakat vasküler hasardan sonra vazokonstriksiyonun gelişmesiyle kan akışı yavaşlar ve kan kaybı gecikir. Trombosit adezyonu, etkinleşmesi ve agregasyonu sonrası primer trombosit plağı bozulmuş damar duvarında oluşur. Trombositlerin maruz kalmış subendotelyumdaki kollajen liflerine adezyonuyla, trombositler kollajene bağlanır (Anonim,1).

Trombosit adezyonu akım hızından etkilenir. Yüksek akım hızı olan bölgelerde (küçük ve orta büyüklükteki arterler gibi), primer adezyon kollajen ve vWf yoluyla meydana gelir. Düşük akım hızı olan bölgelerde (venalar ya da büyük arterler gibi) trombosit adezyonu fibrinojen ile aracılık yapar. Adezyon trombositleri etkinleştirir ve şekilleri yüzey temasına yol açar. Aktif trombositler diğer trombositlerin agregasyonunu uyarır. En önemli agregasyon maddesi protrombinden (faktör II) koagülasyon yolu tarafından oluşturulan trombindir. vWf ve fibrinojen birlikte aynı zamanda trombosit agragasyonunu uzlaştırırlar. Primer trombosit oluşur ve fibrin tarafından stabilize hale getirilmelidir. İlk olarak, sekonder hemostasisin hedefi trombinle fibrin oluşturmaktır (Anonim,1).

Sekonder hemostazis koagülasyon ve geçici hemostatik trombosit plağının kalıcı hemostatik plak oluşumuna dönüşmesini kapsar.

2.7.1 Hemostatik bozukluk testleri
Hemostaz bozukluğunun ortaya çıkarılması için laboratuar incelemelerine gereksinim vardır. Bu amaçla uygulanan basit hemostatik bozukluk testleri mevcutttur (Turgut, 2000).


2.7.1.1 Trombosit Sayımı
Trombositopeninin şiddetinin belirlenmesi için trombosit sayımı önemlidir. Hastalığın prognozunu, şiddetini ve sağaltıma olan cevabın durumunun değerlendirilmesinde yararlı olur. EDTA ile antikoagule edilen kanlarda sayım yapılan elektronik sayıcılarda seyrek olarak psödotrombositopeni saptanabilir. Ayrıca çok büyük trombobsitler, ya da trombositlerin oluşturduğu küçük kümeler bu elektronik sayıcılarda trombosit olarak sayılmadıkları gibi çok küçük eritrositler de trombosit olarak sayılabilir. Bu nedenlerle de periferik kan yaymasının incelenmesi önemlidir (Turgut, 2000).

2.7.1.2. Aktive Edilmiş Parsiyel Tromboplastin Süresi (APTT)
Aktive edilmiş parsiyel tromboplastin süresi intrinsik ve ortak yolları test eder. Sadece VII ve XIII faktörler değerlendirilmez. Genel olarak, Aktive edilmiş parsiyel tromboplastin süresinin uzaması meydana gelmeden önce en az bir faktör normal konsantrasyonu %30’ un altına düşmelidir. Bu test Aktive edilmiş pıhtılaşma zamanından daha duyarlıdır ve primer hemostatik bozukluklardan etkilenmez (Anonim, 2).

APTT’ yi bozan bazı patolojik durumlar şunlardır; (1) Yaygın damar içi koagülopati (2) Heparin sağaltımı (3) Karaciğer hastalıkları (4) Pıhtılaşma inhibitörleri (lupus, edinsel faktör VIII) (5) Faktör I, VII, IX, X, Prekalikreinin kalıtsal eksikliği (6) Masif transfüzyon (7) Kan örnekleri alınırken heparin ile kontaminasyonu (Yavru, 2006).

2.7.1.3. Protrombin Süresi (PT)
Protrombin Süresi ektrinsik ve ortak yolları test eder. Bu şekilde ektrinsik yolun temel testidir. VII faktörünün yarılanma süresinin kısa olmasından dolayı bu test K vitamini eksikliği ya da antagonizme çok duyarlıdır. Aktive edilmiş parsiyel tromboplastin süresinden daha az duyarlıdır (Anonim 2).

PT’ yi bozan bazı patolojik durumlar şunlardır; (1) Karaciğer hastalıkları (2) K vitamini yoksunluğu (3) Antikoagülanların kullanımı (4) Non-steroid antiinflamatuarların kullanımı (5) Hipofibrinojemi (6) Yaygın damar içi koagülopati (DIC) (7) Kalıtsal olarak Faktör V, X, VII yetersizliği (8) Masif transfüzyon (Yavru, 2006).

2.7.1.4. D-dimer
D-dimerler çapraz bağlı fibrin plazmin ile yıkımlandığında oluşan eşsiz FDPs' lerdir. Sadece plazmininin aktifleşmesini gösteren FDPs' lere kıyasla D-dimerler trombin ve plazminin aktifleşmesini gösterirler ve aktif pıhtılaşma ve fibrinolisis için spesifiktirler (Tripodi, 2011; Solak ve ark, 2003; Wakai ve ark, 2003). D-dimer’ ların yarılanma süreleri kısadır (yaklaşık 5 saat). Bu şekilde, sadece yakın zamandaki ve devam eden fibrinolisisin tespit edilmesi için faydalıdırlar. D-dimer testi DIC için duyarlı bir testtir ve geleneksel FDPs analizlerine göre büyük olasılıkla üstündür. Ancak, D-dimer konsantrasyonu her zaman DIC' lı hastalarda yüksek değildir ve yükselmiş D-dimer seviyeleri kesinlikle DIC için özgün değildir. Yüksek konsantrasyon tromboemboli, neoplazi, hepatik hastalıklar, böbrek yetmezliği, kalp yetmezliği, iç kanama ve takip eden cerrahi prosedürleri olan köpeklerde meydana gelir (Anonim, 2).

Plazma D-dimer seviyesi artmış koagülasyon aktivasyonunun (trombogenez) yanında indirekt olarak fibrinolitik aktivasyonun seviyesini de gösterir (Tokgözoğlu, 2002; Lee ve Gingsberg, 1998). Plazma D-dimer seviyeleri protrombotik durumun göstergesi olmanın yanında aynı zamanda tromboembolik riskin göstergesi olabilir (Tripodi, 2011). Venöz tromboembolide D-dimer seviyelerinin kontrollere göre yaklaşık 8 kat arttığı gösterilmiştir. Trombozun yaygınlığı ile plazma D-dimer tepe seviyeleri uyumlu olduğu saptanmıştır (Lip ve Lowe, 1995). Oral antikoagülan sağaltım alan hastalarda intravasküler fibrin sentezi ve trombüs oluşumu azalır. Sonuç olarak plazma D-dimer seviyeleri azalır. Antikoagülan sağaltımının D-dimer seviyelerini azaltması, antitrombotik ilaç uygulamalarının trombogenezi azaltmadaki etkinliğini yansıtır (Mitush ve ark, 1996; Li-Saw-Hee ve ark, 2000). Bu bulgu antikoagülan sağaltım altındaki hastalardaki düşük D-dimer seviyelerinin, yalnızca antiagregan dozda aspirin alan hastalarda gözlenmemesi ile desteklenmiştir. Bu durum tromboembolik riskin azalmasında kumadinin kanıtlanmış yararının, yalnızca aspirin sağaltımı ile gösterilmemesi ile de uyumludur. Sonuçta artmış D-dimer seviyeleri AF’ li hastalarda yüksek tromboembolik riskin öngördürücüsü olabileceği gibi, bu grubun antikoagülan sağaltımından en fazla yarar göreceğini de gösterebilir. Kalp yetmezliği olan mekanik protez kapaklı hastalarda D-dimer ve von Willebrand faktör yüksekliği bu hastaların embolik olaylar açısından izlenmesini gerektirir (Mastroroberto ve ark, 1996).

Tablo 2. Hemostatik test profillerinin yorumlanması (Turgut, 2000).

Hemostatik Test Profillerinin Yorumlanması
Hemostatik Test Profil Örnekleri	Nedenleri
Trombositopeni ve Normal APTT, PT ve FDPs Testleri	Trombosit üretiminin olmaması Trombosit yıkımlanmasının artması Generalize kemik iliği hipoplazisi ve aplazisi Kemik iliği neoplazisi
Trombositopeni ve APTT ve PT’ de uzama ve Pozitif FDPs Testleri	Trombosit faktörlerinin eksikliği/ tüketilmesi Koagülasyon faktörlerinin eksikliği/ tüketilmesi (DIC’ en önemli nedeni)
Normal Trombosit Sayısı, APTT ve PT’ de uzama ve Negatif FDPs Testleri	Multiple koagülasyon defektleri (rodentisit zehirlenmesi, karaciğer hastalıkları) Herediter defekt Heparinli kan örneklerindeki artefakt
Normal Trombosit Sayısı, PT, APTT Uzama ve Negatif FDPs Testleri	İntrinsik sistemde herediter defekt Hemokonsatrasyon
Normal Trombosit Sayısı, APTT, PT Uzama ve Negatif FDPs Testleri	Ekstrinsik sistemde herediter defektler (Örn. faktör VII yetersizliği) Vitamin K yetersizliğinin erken dönemi
Normal Trombosit Sayısı, APTT, PT Uzama ve Negatif FDPs Testleri ile Birlikte Hemorajik Diyatezin Olması	Vasküler hasar Trombosit fonksiyon defekti Herediter trombosit anormalikleri von Willebrand Hastalıkları

2.8. Koagulasyon
Koagülasyonun son ürünü olan trombosit plağı içinde ve etrafında fibrin bağlarının oluşumudur. Böylece plak daha da sağlamlaşır ve tekrar kanama ihtimali azalır. Koagülasyon kaskadı üç yol içerir bunlar; ekstrinsik, intrinsik, ortak yoldur (Anonim, 1). Koagülasyon kaskadının sınıflandırılması in vivo koşullara karşılık gelmemektedir, ancak laboratuvar testlerinin yorumlanması için yararlı olur (Brooks, 2000; Furie, 2000). Ekstrinsik olarak nitelenmesinin nedeni bu yolun komponentlerini ekstraselüler alandan sağlamasıdır (Anomin 1; Smith, 2010). Ekstrinsik yol bir travma tarafından başlatılır ve organ kapsülü ve mukoza zarı gibi farklı dokulardan doku faktörü (TF) salınımına yol açmaktadır. Bu durumda faktör IV (protrombin) aktive eder (Smith, 2010).

Aktive FVII (FVIIa) - TF kompleksi FX aktive eder. Bu durum ortak yolun ardından ekstrinsik yolun kesişme noktasıdır (Stokol, 2000). İn vivo olarak ekstrinsik sistem fonksiyonlarının faktör XI, VII ve V’i aktive etmek için eseri miktarda hızlı trombin sağladığı bildirilmektedir (Turgut 2000). Ekstrinsik yol ile oluşturulan trombin (az miktarda) intrinsik yolun primer başlatıcısıdır (Anonim, 1). Az miktarda trombin faktör XI aktivasyonu yolu ile intrinsik yolu başlatır. Faktör XI yüksek moleküler ağırlığa sahip kininojen-prekallikrein kompleksi (kontakt aktivasyon) tarafından faktör XII'nin aktivasyonu ile otomatik aktivasyon şekillenir. Bu durum, PK’nın kallikrenine dönüşümüne yol açar, daha sonra ise yüksek moleküler ağırlığa sahip kininojen’nin bradikinine dönüştürülmesinden sorumludur (Anonim,1; Smith, 2010; Colman, 2006). Bradikinin doku plazminojen aktivatörü salınımına yol açar (Brown, 1999). Bu aşamada koagülasyon etkisinden daha çok profibrinolitik ve antikoagülan etkisi önemlidir (Smith, 2010). Faktör XI (FXI) aktivasyonu sonrasında aktive edilmiş faktör XI, faktör IX’u aktive eder. Faktör X’nun (intersection point) aktifleştirilmesi için aktive FIX - FVIIIa kompleksi kalsiyum ve trombositler (tenase kompleksi) ile etkileşime girer. Kesişme noktasında ortak yol başlar ve FXa - FVa kompleksi oluşturulur (Anonim1). Bu kompleks kalsiyum ve trombosit fosfolipid (protrombinaz kompleksi) ile etkileşime ve protrombinden trombinin gelişimi (büyük miktar) fibrinojeni fibrine dönüştürür (Anonim1, Smith 2010). Faktör VIII ve trombinin birlikte aktivasyonu, bu durumda kalsiyum ile birlikte fibrin polimerleri çapraz bağlı fibrin polimerlerin oluşturulmasından sorumludurlar (Stokol ve ark, 2000). Fibrin polimerleri belirli bir miktarda ise sadece faktör VIII aktive olur. Kalsiyum ile birlikte fibrin polimerlerinden çapraz bağlı fibrin polimerlerinin oluşumundan sorumlu olan trombin aynı zamanda FVIII’i aktive eder (Anonim, 1). FVIII ancak belirli bir fibrin polimeri olduğunda aktive olur (Roberts ve ark, 2006).

3. GEREÇ ve YÖNTEM

3.1. Materyal Toplanması ve Örneklerin Hazırlanması
Adnan Menderes Üniversitesi Ziraat Fakültesi Koyunculuk ünitesinden; klinik ve laboratuvar muayene (tam kan sayımı ve serum biyokimyasal bulgularına) sonuçlarına göre yaklaşık 12-14 aylık yaşlı, ortalama 30-40 kg ağırlığında gebe olmayan karya ırkı 14 adet sağlıklı dişi koyun seçildi. Seçilen bu koyunlar gruplara rastgele dağıtılarak Grup 1 (n=7) ve Grup 2 (n=7) olmak üzere iki guruba ayrıldı. Hayvan grupları ayrı padoklara alınarak çalışma süresince besleneme rejimleri değiştirilmeden toplam karışım rasyonu ve adlibitum su ile bakım-yönetimleri sağlandı. Çalışma kapsamında oluşturulan Grup 1’deki koyunlara fluniksin meglumine (Flumed, Alke, Türkiye) 2,2 mg/kg/gün dozunda intramusküler, Grup 2’deki hayvanlara da meloksikam (Maxicam, Sanovel, Türkiye) 0,5 mg/kg/gün dozunda subkutan olarak ilk 3 gün boyunca uygulandı. Her iki gruptaki hayvanların koagulasyon profillerinin [protrombin zamanı (PT), aktive edilmiş tromboplastin zamanı (APTT), fibrinojen konsantrasyonu] ve trombosit sayımının belirlenebilmesi için vena jugularis’den 0.saat, 3.saat, 6.saat, 12.saat, 24.saat, 2.gün, 3. gün, 6. gün, 12.gün ve 24.günde kan örnekleri sodyum sitratlı ve EDTA’ lı tüplere 2’ şer ml alındı. Ayrıca çalışmaya başlamadan koyunların sağlıklı olup olmadığının belirlenip yukarıda belirtilen hematolojik ve biyokimyasal analizlerin yapılabilmesi için antikoagulanlı (EDTA’ lı) ve antikoagulansız tüplere de V. jugularis’ den kan örnekleri alındı. Bununla birlikte çalışma süresincede vena jugularis’ den sitrat içeren tüplere alınan 2 ml kan örneklerinden hiç vakit kaybetmeden 3000 devir / dk santrifüj ile plazma elde edilip PT, APTT ve fibrinojen konsantrasyonları mikrokoagulometre (Finecare, Wondfo Biotech, Çin Bejing Precil 4 kanallı yarı) ile ölçüldü. EDTA’ lı tüplere alınan kan örneklerinde ise trombosit sayıları tam kan sayım cihazı (Coulter –Abacus Junior Vet, Macaristan) ile ölçüldü. Yapılan çalışmanın dizaynı Şekil 1’ de özetlenmiştir.



Şekil 3. Çalışma Dizaynı.
Çalışmada analizi yapılan koagulasyon profilleri (PT, APPT, fibrinojen), tam kan sayım ve biyokimyasal parametrelerin belirlenebilmesi için yapılan analizler ve yöntemleri Tablo 3’ de özetlenmiştir.


Resim 1. ADÜ Ziraat Fakültesi Koyun İşletmesi.
Tablo 3. Çalışmada İzlenecek Labaratuvar Yöntemler.

ÖRNEK	PARAMETRE/ ÖLÇÜM	YÖNTEM/ CİHAZ
EDTA’ lı tam kan	Tam kan sayımı	Coulter- Abacus Juniorvet
Sitratlı plazma	APTT PTT Fibrinojen	Mikrokoagülometre Mikrokoagülometre Mikrokoagülometre
Koagulansız kan	Biyokimyasal	Refretron ve LabegoPT10 cihaz (Samsung IVP Reader)

Resim 2. Koyun-V. Jugularisten kan alımı
3.2. Hemostatik Profil ve İlişkili Analizler
3.2.1. Mikrokoagülometre test prosedürü
Mikrokoagülometre cihazı (Beijing Precil 4 kanallı yarı otomatik koagülometre cihazı) (Resim 3) ile gerçekleştirilen ilgili analizler ve test prosedürleri aşağıda anlatıldı.


Resim 3. Veteriner Fakültesi İç Hastalıkları A.B.D’ da mevcut Bejing Precil 4 kanallı yarı otomatik koagülometre cihaz
3.2.1.1. Protrombin Time Reaktifi (PT)

PT reaktifi faktörlerin analizlerinin yapılıp PT’ nin belirlenmesi için kullanıldı.

Resim 4. PT reaktifi

Test prensibi; Özellikle oral antikoagülan sağaltımının indüksiyonu ve monitörizasyonu için uygun olan PT, ekstrinsik ile ortak yollarda koagülasyon faktörlerinin miktarının tespiti için tarama aracı olarak kullanılmaktadır. Karaciğerin sentez yeteneğinin kontrolü içinde yaygın olarak kullanılan PT aynı zamanda karaciğer hastalıklarında da kullanılmaktadır. Plazmayı test etmek için rekombinant insan doku faktörü karışımı ve kalsiyum iyonları ilave edilir böylece koagülasyon mekanizması başlatılmış olur. Ölçüm ise fibrin pıhtısı oluştuktan sonra yapılır.

Alınan örneğin doku sıvıları ile kontaminasyonu ve hemolizin önlenmesi gerekmekteydi. Örneklerin hacmi beklenenin % 90’ nından az ise analiz gerçekleştirilmedi. Numuneler alındıktan sonra en kısa sürede 3000 devir/dk’ da santrifüj edildi. Test hemen yapılacaksa plazma, çökmüş hücreler üzerinde kalabiliceğinden ya da ayrılabileceğinden, plazmanın ayırılabilmesi için plastik transfer pipeti ile plastik tüplere aktarıldı. Testin yapılacağı zamana kadar buzdolabında tutuldu ve üretici firmanın belirttiği şekilde asla buz üzerinde tutulmamasına özen gösterildi. Örnekler alındıktan sonra en fazla 2 saat içersinde testin yapılması sağlandı. Örneklerin 5 dakikadan fazla 37 °C’ de beklememelidir.

Test prosedürü; PT reaktifinin 37 °C’ ye ön ısıtma uygulanıp test tüpüne 0.1 ml plazması eklendi ve 37 °C' de 3 dakika boyunca ön ısıtılmaya bırakıldı. Daha sonra ön ısıtmaya tabi tutulan PT reaktifinden 0.2 ml plasmaya eklenerek karıştırıldı. PT reaktifinin eklenmesi ile eş zamanlı olarak kronometre başlatıldı ve koagülasyon zamanı tespit edildi.

Resim 5. Mikrokoagülometre yardımı ile PT ölçümü
3.2.1.2. FIB deney kiti

Plazma örneklerinde FIB’ in kantitatif olarak belirlenmesi amacı ile kullanıldı.

Test prensibi; İlk olarak Clauss tarafından tarif edilen yönteme dayandırılan trombin pıhtılaşma süresi ile FIB deneyinde trombinin yüksek konsantrasyonlarında dilue plazmada koagülasyon için gerekli olan zaman koagülasyon zamanı ile ters orantılıdır.


Resim 6. Trombin reaktifi ve Imidazole saline buffer
İçersinde bulunan bileşenler şu şekildedir;

1- FIB Assay kiti

2- Imidazole buffered saline

3- FIB tavsiye kiti

4- Trombin ayıracı

Sığır trombin tamponu trombin ayıraç kompozisyonu olarak kullanıma hazırdır. Açılan şişeler gerektiği ölçüde kullanıldıktan sonra prospektüste belirtildiği üzere dondurulmayıp +2 °C ile +8 °C arasında saklanılarak 30 gün süre içerisinde tüketildi. Açılmayan şişeler ise (Resim 6) +2 °C ile +8 °C’ de muhafaza edildi. Şişeler açılmadan önce ters çevrilerek yavaş çalkalama hareketi ile karıştırıldı. Sodyum sitratlı insan plazması içeren FIB referans plazması kompozisyonu 0.1 ml distile su ile sulandırıldı. Sulandırılan bu materyal +2 °C ile +8 °C arasında 8 saat stabil olarak kalabilir. Dondurarak kurutma öncesi buffer maddeler ile stabilize edici maddeler ilave edilerek çözülme tamamlanana kadar yavaşça karıştırıldı. Imidazole Buffered Saline kompozisyonun pH’ sı 7.35 ±0.2 olup içerisinde % 0.1 sodyum azit koruyucu olarak bulunur.

Sodyum azit asidik koşullar altında hidrazoik asit veren, son derece zehirli bir bileşik olduğu için atılmadan önce akan su ile seyreltildi ve oluşabilecek birikim sonucu metal borularda patlayıcı koşulları geliştirebileceğinden bol miktarda su ile yıkandı. Ürünlerde bozulma belirtisi olan plazma şişelerindeki vakum eksikliği, düzensiz değerler ya da renk değişmeleri gibi durumlar dikkatle takip edildi.

Alınan örneğin hemolizinin vede doku sıvıları ile kontaminasyonun önlenmesi gerekmektedir. Analizin gerçekleştirilmesi için örneklerin hacminin beklenenin % 90’ nından az olmaması gerekmektedir. Örnekler alındıktan hemen sonra 3000 devir / dk santrifüj ile plazma elde edildi. 22-24°C’ de tutulan örnekler alındıktan sonra 2 saat içersinde test yapıldı.

Test prosedürü; FIB referans plazması Imidozole buffer saline içerisinde en az beş farklı yoğunlukta hazırlanıp plazmanın faktörler ile etkileşimini minimize edebilmek için en az 1/3 oranında dilue edildi. Plazma 1/10 oranında Imidazole buffer saline solüsyonu ile sulandırıldı. 0.2 ml’ lik dilüsyon 37 °C’ de 3 dakika ön ısıtma uygulandı ve sonra 0.1 ml’ lik trombin reaktifi daha önceden ısıtılan dilüsyona ilave edildi. Trombin reaktifine ön ısıtma uygulaması gerekmediğinden bu işlem yapılmadı. Trombin reaktifi eklenmesi ile aynı anda kronometrenin başlatıldı ve koagülasyon zamanı belirlendi.
3.2.1.3.Aktive parsiyel tromboplastin zamanı (APTT)

Aktive parsiyel tromboplastin zamanının (APTT) belirlenmesi ve ellajik asit aktivatörü kullanan diğer APTT faktörlerinin analizleri için kullanıldı.

Test prensibi; APTT esas olarak iç pıhtılaşma bozukluklarının değerlendirilmesinde ayrıca faktörler 2, 5, 10’ un ve FIB' nin işlevindeki eksiklikleri saptamak için bir tarama aracı olarak önemlidir. APTT, heparin tedavisinin etkinliğini izlemek için bir araç olarak kullanılmıştır. APTT tahlili, test örneğine bir plazma aktivatörü ve fosfolipit içeren bir reaktif eklenerek gerçekleştirilir. Karışım uygun aktivasyon için 37 ° C'de 3 dakika bekletilir. Daha sonra kalsiyum iyonlarının ilavesi koagülasyon işlemini başlatır ve koagülasyon süresi ölçülür.