Diplomová práce

Introdukce podle Svoboda (1981)

Tabulka 5 - ověřené údaje o výskytu zástupců sekce:

taxon	lokalizace	poznámky
T	Benešov - dvě zahrady při cestě z nádraží na zámek Konopiště
T	Bezděkov - zahrada p. Plného, č.p. 41	*Původ a stáří zřejmě stejné jako r. p. Macury z Hronova - Žabokrk (majitelka v r. 2004 uváděla stáří 30 let - výsadba v 70. letech); *Výška 10 m
T	Bílá Lhota u Litovle - arboretum 2x	*Kabelík r. 1972 vyšetřoval i antibiotické vlastnosti, není ale jisté, zda právě na těchto jedincích
T	Hluboká n. Vltavou - zámecký park	*Výška asi 10 m
T	Hronov - Žabokrky - zahrada p. Macury, č.p. 26	*Majitel uvádí původ v zahradnictví u místní vlakové zastávky, výsadba asi z roku 1967 *Výška 6 m
T	Konopiště - Růžová zahrada 2x	*Z pohledu z Růžové zahrady levá vysoká 5 m, pravá vysoká 4 m, ale nevhodně seřezána
T	Kopidlno - zámecký park	*Výška asi 4 m
T	Kórnik (Polsko) - arboretum 2x	*Větší rostlina označena jako M. obovata, ale jde o evidentní záměnu
T	Kostelec nad Černými Lesy - arboretum
T	Nový Dvůr u Opavy - arboretum 2x	*Rostliny se liší fenologií a plodností
T	Písek - arboretum VOŠL a SLŠ
T	Plzeň - Křižíkovy sady 5x	*Porost 5 rostlin
T	Plzeň - Šafaříkovy sady (před ZČ muzeem)
T	Plzeň - ZOO	*Zde označovaná jako M. obovata
T	Praha - Botanická zahrada PřF UK	*Původně záměna s M. obovata
T	Praha - Košíře, Píseckého 1
T	Praha - zastávka 'Sídliště Malešice', před marketem Delvita 10x	*Vzrůst rostlin označených od vchodu do marketu: 1-6m; 2-4m; 3-6m, 4-5m; 5-6m; 6-6m; 7-6m; 8-6m; 9-5m; 10-3,5m
T	Průhonice - areál VÚKOZ
T	Průhonice - zámecký park a obora 3x	*Jedné rostlině (T2/1) se přelomil stářím kmen
T	Ráby - před Perníkovou chaloupkou
O	Bonn (Německo) - botanická zahrada, podle fotogalerie K. Stübera
O	Cluj-Napoca (Rumunsko) - univerzitní botanická zahrada 2x
O	Kostelec n. Černými Lesy 3x	*Označení: d3 vedle chaty, g1 pod chatou, g2 spodní
O	Praha - Botanická zahrada PřF UK
O	Průhonice - Dendrologická zahrada, zadní partie 2x	*1 rostlina panašovaná (skvrnité listy)
O	Průhonice - zámecká obora
taxon	lokalizace	poznámky
O	Velké Březno - zámecký park	*Výška 9 m, původně dvoukmen + 1 mladší kmen
O?	Praha - Kinského zahrada	*Obražená rostlina, v r. 2004 zřejmě uschla
O?	Průhonice - při pěší cestě do Újezdu po levé straně
O?	Praha - Stromovka, poblíž areálu Matějské pouti	*Nová výsadba, rostlina přes zimu 2004/2005 uschla
H	Průhonice - zámecký park a obora	*Výsadby z roku 1952, cca 125 jedinců
H	Lednice na Moravě - zámecký park 3x	*Vzrostlý jedinec u Benátské kašny byl parazitován jmelím
H2	Herkenrode (Belgie) - arboretum	*Semenáčky původem od kříženců z Průhonic
H2	Jižní Čechy - chalupa J. Burdy (průhonický dendrolog)	*Vlastní výsadba J. Burdy
H2	Lednice na Moravě - zámecký park	*Podle Doc. Pejchala semenáček kříženců z Průhonic
H2	Praha - ZOO -na dvou místech	*V roce 2001 bylo místním rostlinám 12 let, byly zde 2 skupiny - mladší a starší, mezi hybridy (F2) jsou údajně i botanické druhy *V r. 2004 nová výsadba první skupiny, druhá skupina seschlá, rostliny neodstraněny
H?	Kórnik - arboretum	*Lokalizována v části arboreta u institutu PAN, nová výsadba
H?	Průhonice - Chotobuz, č.p.170

Z tabulky 5 jasně vyplývá, že Magnolia tripetala je pěstována na nejvíce místech (soukromé zahrady), M. obovata méně často (parky, botanické zahrady) a pěstovat se již začínají i kříženci F2 generace. Pokud jde o počty jedinců, zcela unikátní jsou porosty křížence v Průhonicích, které ve světovém měřítku nemají obdoby (125 jedinců).

Rozšíření zmíněných taxonů v současné době příliš nesouvisí se sadovnickou hodnotou. Kříženec je vlastně 'nový taxon' (velmi hodnotný), M. obovata je sadovnicky hodnotnější než M. tripetala, zároveň ale méně vhodná pro místa s omezeným prostorem (pro ně vhodnější M. tripetala, proto zřejmě M. tripetala má dosud větší rozšíření). Nelze vyloučit hypotézu, že M. tripetala se do našich zahrad a parků dostala pod označením sadovnicky hodnotnější M. obovata.

Označení jedinců rostoucích v Průhonickém parku:
Každý významný vzrostlý jedinec má v Průhonickém parku své identifikační číslo (např. 015/A-005/16). To skrývá kód jeho lokalizace (ve kterém segmentu a jeho části daný jedinec roste), kód taxonu rostoucího v daném segmentu a číslo konkrétní rostliny. U 'deštníkových magnólií' je v celém Průhonickém parku kombinace kódu taxonu a čísla konkrétní rostliny vždy unikátní a nezaměnitelná, proto k identifikaci stačí poslední lomený údaj (např. 5/16 - číslo natřené i na kmeni stromů). Protože bez podkladů není zřejmé o jaký taxon se jedná, byl údaj doplněn kódem taxonů používaném v této práci (H, O, T).
6 Karyologie
6.1 Úvod
U rodu Magnolia byla prokázána jak polyploidie, tak aneuploidie. S polyploidií je možno se setkat jen u některých sekcí, u sekce Rytidospermum však odchylky od počtu 2n=38 zjištěny nebyly. Podrobnější informace jsou uvedeny v 'multimedium-Magnolia-karyologie'.

Protože studované taxony se výrazně neliší ani počtem chromozomů, ani velikostí chromozomů, bylo možno předpokládat, že se tyto taxony výrazně neliší ani obsahem jaderné DNA. Ani tento předpoklad však často neplatí (J. Štěpánek - osobní sdělení), proto bylo třeba rozdíly mezi studovanými taxony vyšetřit.

Vzhledem k hybridnímu původu bylo možno uvažovat v případě Magnolia obovata x M. tripetala o polyploidizaci (allopolyploidizaci) v F2 generaci kříženců (vzniklých splynutím neredukovaných gamet křížence F1 generace). K polyploidizaci mohlo dojít u jedince předpokládané F2 generace označeného H7/31, který se při isoenzymové analýze lišil od ostatních rostlin zpravidla zcela jedinečným patternem (odlišný počet a poloha jednotlivých alel).

V databázi Bennett (2005) dosud chybí údaje C-values u naprosté většiny druhů magnólií (pouze 3 záznamy), původním cílem bylo do této databáze doplnit údaje k M. obovata, M. tripetala a jejich kříženci.

6.2 Cíle karyologické analýzy
Cílem karyologických výzkumů bylo stanovit chromosomové počty studovaných druhů (vyloučení polyploidie a aneuploidie). Dále byly těmito metodami ověřovány projevy hybridizace (jak se liší studované taxony obsahem jaderné DNA - změření obsahu jaderné DNA u studovaných taxonů a výjimečných rostlin).

6.3 Klasické metody
6.3.1 Metodika a postup
Pro stanovení počtu chromosomů byla použita metoda tzv. roztlakových preparátů. Tato metoda patří mezi standardní 'rychlé' karyologické postupy (více např. Krahulcová 1998). Zvolený postup byl následující:
1) odběr vzorků

Jako zdroj mitoticky aktivních buněk byly použity kořenové špičky jedno- až dvouletých semenáčků kříženců a rodičovských druhů pěstovaných v květináčích v experimentální zahradě v Průhonicích. Vlastní odběry vzorků byly prováděny po desáté hodině dopoledne v květnu r. 2004 (v roce 2002 až v půli července - metafáze bylo možno také pozorovat).

2) předpůsobení

Předpůsobení se používá ke snížení viskozity cytoplazmy a narušení struktury dělícího vřeténka, čímž se dosáhne zablokování mitosy ve fázi metafáze, kdy jsou chromozómy maximálně kondenzované a rozprostřené a lze je tedy počítat.

Pro předpůsobení byly vybrány nasycené roztoky p-dichlorbenzenu nebo 1-bromnaftalenu (obě chemikálie se osvědčily stejně dobře). Odebrané kořenové špičky byly předpůsobení vytaveny cca 3 hodiny (ve tmě a při pokojové teplotě).
3) fixace

Spočívá v usmrcení tkáně při současném zachování neporušené struktury chromozomů. Byla používána tzv. Farmerova fixáž (směs 96% ethanolu a ledové kyseliny octové v poměru 3:1). V této směsi byly kořenové špičky ponechány v chladu a temnu (lednička) asi 19 hodin (přes noc).

4) macerace

Vede k rozrušení střední lamely buněk, což umožňuje dosáhnout při následném roztlaku rozprostření buněk do jedné vrstvy.

Při maceraci byly kořenové špičky přeneseny na minutu či dvě do koncentrovaného roztoku HCl a 96% ethanolu v poměru 1:1. Podle zkušeností bylo pletivo kořenových špiček magnólií proti jiným rostlinám odolnější, bylo třeba vyčkat na zbělení kořenových špiček.
5) barvení a roztlak

Barvení je konečnou fází přípravy preparátů. Po skončení macerace byly kořínky vyjmuty a umístěny na podložní sklo. Poté byla ostrou žiletkou odříznuta kořenová špička (s dělícím se meristémem), která byla následně obarvena - zakápnuta lakto-propiono-orceinem (roztok orceinu ve směsi kyseliny propionové a mléčné). Obarvená kořenová špička byla přiklopena krycím sklem a poklepáním preparační jehlou bylo dosaženo roztlaku (pro dobré probarvení bylo obvykle přiklopení krycího sklíčka několikrát opakováno). Poté byly přiložením filtračního papíru odsáty zbytky barviva.

6) pozorování pod mikroskopem

Preparáty byly pozorovány pod mikroskopem při zvětšení 1250x s olejovou imerzí. Osvědčilo se pozorování v zeleném světle a se zastíněním. Nakonec se podařilo chromozomy v metafázích semenáčků kříženců i vyfotit. U každého taxonu byly počítány chromozómy alespoň od tří semenáčků.

6.3.2 Výsledky
Použitá metodika se osvědčila (i když obvykle již bylo poměrně těžké nalézt buňky s vhodně uspořádanými a viditelnými chromozomy). Podařilo se zjistit počet chromozomů u semenáčků jak Magnolia obovata x M. tripetala, tak ověřit chromozomové počty jejích rodičovských druhů - vždy 38 chromozomů. Chromozomy všech studovaných taxonů jsou středně veliké, centromera bývá poněkud posunutá od středu, časté jsou sekundární konstrikce (J. Štěpánek - osobní sdělení, pohled na několik metafází jednoho-několika preparátů).

Obrázek 6.3.2 - mikrofotografie somatické metafáze u kořenové špičky semenáčku vypěstovaného ze semen křížence opylovaného pylem křížence (F2 generace)

6.4 Průtoková cytometrie
6.4.1 Úvod
Průtoková cytometrie (orig. flow cytometry, dále FCM) byla původně vyvinuta jako metoda rychlého počítání krevních buněk. S postupujícím technickým rozvojem se tato metoda začala používat i v různých dalších odvětvích biologie, mimo jiné i v taxonomii rostlin.

Výhodou této metody kromě její rychlosti i ceny je, že nevyžaduje dělící se buňky ve vzorcích (kořenových špiček či mladých prašníků), takže není nutné pracovat se semenáčky (které je obtížné vypěstovat a kterým v pozdějším období vegetace během roku kořínky také již nepřirůstají) nebo květy (dostupnými v relativně krátkém období roku). Je to navíc metoda nedestruktivní (nevyžaduje velké množství pletiva analyzované rostliny), vyžaduje však nutnost většinou pracovat s živým materiálem, není příliš citlivá k aneuploidii (pouze do somatického počtu 2n=30) a některé sekundární metabolity mohou nepříznivě ovlivnit kvalitu měření. Podrobněji práce Suda (2005).

6.4.2 Metodika
Suspenze obsahující fluorescenčně obarvená jádra (DNA) buněk analyzované rostliny a standardu (rostlina se známým obsahem jaderné DNA, ke které vztahujeme daná měření - standard se musí svým obsahem DNA co nejvíce blížit analyzovaným rostlinám, aby tak nedocházelo ke zkreslení výsledků) je přiváděna do komůrky cytometru, kde je pomocí excitačního světla detekována fluorescence proudících částic (seřazených jedna za druhou). Digitalizovaná data jsou počítačově převedena do histogramu (obrázek 6.4.2), který vyjadřuje distribuci intenzity fluorescence detekovaných částic. Histogram se skládá z jednoho nebo více píků, podle charakteru analyzovaného vzorku. Poloha píků na ose x je úměrná obsahu DNA jader, poloha na ose y vyjadřuje počet analyzovaných částic s konkrétním obsahem DNA. Koeficient variability píku (CV = směrodatná odchylka/průměr x 100 [%]) odráží jak variabilitu intenzity fluorescence, tak přesnost vlastní analýzy. Obvykle se pohybuje v rozmezí 1-10%, nicméně pro kritické analýzy je třeba se držet na dolní hranici uvedeného rozpětí (kolem 3%), Suda (2005).

Jedná se o metodu obecně známou a rozšířenou, proto je možno zájemce o její bližší poznání odkázat např. na internetové stránky laboratoře BÚ v Průhonicích, URL: http://www.ibot.cas.cz/fcm/

Obrázek 6.4.2 - histogram intenzity fluorescence izolovaných jader barvených propidiumjodidem u vzorku M. tripetala 5/1 (pravý pík standard - Zea mays)

6.4.3 Postup
Všechna měření byla prováděna na průtokovém cytometru Partec Pa II v Botanickém ústavu AV ČR v Průhonicích, pouze 3 měření z 15.6.2005 a další 3 měření z 28.6.2005 byla měřena na cytometru Partec CyFlow (měření z tohoto cytometru byla z výsledných výpočtů vyřazena - cytometry nejsou vzájemne zkalibrované).

Příprava vzorků pro FCM analýzu byla upravena podle Otto 1990 - 'two step procedure'. Tento postup je v Botanickém ústavu v Průhonicích běžně využíván k analýzám nejrůznějších rodů rostlin. Pro barvení jaderného chromatinu byl používán propidiumjodid (patřící mezi tzv. interkalační barviva - na dvoušroubovici DNA se vážou kvantitativně, intenzita fluorescence je proto přímo úměrná celkovému obsahu DNA). Protože v databázi Bennett 2004 (C-values Database) údaje k rodu Magnolia byly omezené (jen M. kobus a M. soulangeana, kde situaci komplikovala patrně i polyploidie - rozsah hodnot 2C u těchto druhů byl: M. kobus 1,80 pg; M. x soulangeana 11,96-14,20 pg), byla první pokusná měření provedena s hrachem (Pisum sativum 'Ctirad') jako standardem (rostlina se známým obsahem jaderné DNA, ke které vztahujeme daná měření) a extrakčním pufrem bez PVP 40 (polyvinylpyrolidon). Posléze se ukázalo, že vhodnějším standardem je kukuřice (Zea mays 'CE-777') a použití extračního pufru Otto I + PVP 40 (PVP 40 nutné pro vyvázání přítomných fenolických látek).

Příprava suspenze intaktních jader:
1) Část čistého listu (asi 0,5 cm²) analyzované rostliny se stejným množství pletiva standardu jemně rozsekáme žiletkou v Petriho misce v 1 ml chlazeného extračního pufru Otto I + PVP 40.

2) Vzniklou suspenzi několikrát (3x) promícháme nasátím do špičky automatické pipety a zpět (za účelem vymytí jader ze dna misky). Poté ji přefiltrujeme do předem označené zkumavky (Sarstedt, polystyren, obsah 3,5 ml) přes nylonový filtr (Uhelon, velikost oka 42 m²).

3) Vzorek centrifugujeme při 150 g po dobu 5 minut.

4) Supernatant opatrně odlijeme tak, aby na dně zůstalo přibližně 100 l kapaliny.

5) Obsah zkumavky protřepáme, aby se sediment promísil se zbytkem supernatantu. Poté přidáme 100 l vychlazeného pufru Otto I + PVP 40.

6) Vzorek inkubujeme při pokojové teplotě asi 30 minut bez přístupu světla.

Barvení intaktních jader:
7) Ke vzorku přidáme 1 ml barvícího roztoku PI (pufru Otto II s fluorochromem propidiumjodidem, merkaptoetanolem a RNAsou). Vzorek protřepeme a necháme se ho probarvovat asi 30 min. Je důležité dodržovat dobu barvení. Pokud nedojde k dostatečnému probarvení, jádra se barví ještě v průběhu analýzy a dochází tak k posunu píků po ose x. Pokud je vzorek ponechán příliš dlouho stát, dochází k jeho oxidaci a růstu signálů mimo požadované oblasti.

8) Vzorek analyzujeme pomocí průtokového cytometru (při rychlosti proudících částic v komůrce cytometru cca. 50/s)

 Použité roztoky:

Pufr Otto I:

(množství 200 ml)

4,2 g 0,1 M monohydrát kyseliny citrónové

1 ml 0,5% (v/v) Tween 20

- doplnit destilovanou H₂O do 200 ml

- přefiltrovat přes nylonový filtr (velikost oka 22 μm)

- skladovat při 4 ˚C
Pufr Otto I + PVP 40:

1,0 g PVP 40

- doplnit pufrem Otto I do 100 ml

- přefiltrovat přes nylonový filtr (velikost oka 22 μm)

- skladovat při 4 ˚C

Pufr Otto II:

28,65 g 0,4 M Na₂HPO₄  12 H₂O

- doplnit destilovanou H₂O do 200 ml

- přefiltrovat přes nylonový filtr (velikost oka 22 μm)

- skladovat ve tmě při pokojové teplotě
Zásobní roztok PI (1 mg/ml):

50 mg propidiumjodid

- rozpustit v 50 ml redestilované H₂O

- přefiltrovat přes nylonový filtr (velikost oka 0,22 μm)

- rozpipetovat do eppendorfek po 1 ml

- skladovat při teplotě –20 ˚C

Barvící roztok PI (50 μg/ml):

500 μl zásobní roztok propidiumjodidu

10 ml pufr Otto II (přefiltrovat – velikost oka 22 μm)

20 μl 2-merkaptoethanol

- přidáním 500 μl RNAsy vznikne barvicí roztok na měření obsahu DNA

Tabulka 6.4.3 - standardy použité při cytometrických analýzách:

standard	2C obsah DNA [pg]	autor
Pisum sativum 'Ctirad'	9,07	Doležel 1992
Zea mays 'CE-777'	5,43	Lysák 1998

C – velikost nereplikovaného haploidního genomu

Výpočet 2C vzorku:

= 5,43 / index

6.4.4 Výsledky
Histogramy s daty FCM analýz jsou na přiloženém CD-ROMu v adresáři 'data-fcm'. K jejich otevření je třeba nainstalovat program FloMax dostupný v adresáři 'multimedium-programy-flomax'. Návod ke zpracování dat (.fcs souborů) je odkazován v kapitole 'multimedium-pruhoniciana-průtoková cytometrie'.

Pro stanovení obsahu jaderné DNA u nějakého taxonu musí být obvykle splněn požadavek měření alespoň na 3 rostlinách měřených na stejném cytometru alespoň 3krát (měření opakovaná po sobě - H5/15 a H1/1 byly měřeny 4x, pouze ale 3 po sobě jdoucí měření byly zaznamenány do výsledných tabulek a výpočtů hodnot 2C), pokaždé navíc v různé dny (při každé sérii měřeních v jednom dni může cytometr měřit s různě velkou přesností). Odchylky měření u jednotlivých rostlin by také neměly být větší než 2% (chyba měření cytometru garantovaná výrobcem je 2%). Tento požadavek přesně nebyl splněn u žádného taxonu (měřeno ale bylo více rostlin, než jen 3 u každého taxonu), proto výsledky nejsou zatím publikovatelné.

Výpočet hodnoty 2C u M. tripetala vychází z jedné rostliny měřené 3x, dvou rostlin měřených 2x a jedné rostliny měřené jednou. Výpočet hodnoty 2C u M. obovata vychází z měření jedné rostliny 3x a čtyřech rostlin měřených 2x. Výpočet hodnoty 2C u křížence vychází z měření dvou rostlin měřených 3x, jedné rostliny měřené 2x a směsných vzorků 5ti rostlin měřených 2x. Atypické rostliny křížence ('divná malá' a 'divná obražená') byly vyhodnoceny zvlášť. Výsledky měření shrnují tabulky v této kapitole.

Odchylky měření u jednotlivých rostlin větší než 2% jsou v posledním sloupečku tabulky 6.4.4a jsou vyznačeny červeně. V kritických analýzách by výsledné hodnoty 2C těchto měření rostlin neměly figurovat, do výsledku této práce však byly zahrnuty (kompenzace nedostatku dat). Nepřesnosti měření lze připočítat přítomným sekundárním metabolitům (fenolické látky se nepodařilo ze vzorků nepodařilo zcela odstranit). Hodnoty CV píků vzorků se pohybovaly v rozmezí 2,73-6,38%, tedy často více něž je hodnota dolní hranice kritických analýz (do 3%), ale stále se jedná o hodnoty běžného rozmezí (1-10%). Nejvyšší CV píku standardu bylo naměřeno 6,33%.

Z průměrných hodnot měřeních konkrétních rostlin byl vypočítán vždy průměr pro každý taxon. Minimálně dvě měření každé rostliny by měly zaručovat odhalení přílišných rozdílů mezi naměřenými hodnotami a tedy pravděpodobné nepřesnosti konkrétních měření. Protože jsou však obvykle vyžadována minimálně 3 měření/rostlinu, byl tento požadavek obvykle kompenzován počtem měřených rostlin (alespoň 4). Jediné měření T Kostelec do výsledných výpočtů 2C M. tripetala bylo zařazeno, neboť toto byť jediné měření se nevymykalo z rozpětí naměřených hodnot u daného taxonu.

Dle průměrných hodnot obsahu jaderné DNA má kříženec hodnotu mezi rodičovskými druhy a situace se blíží k možnosti potvrzení intermediarity křížence mezi rodičovskými druhy. Rozpětí naměřených hodnot 2C se mezi jednotlivými taxony prolínaly a vzhledem k omezenému počtu měření a malým rozdílům hodnot mezi analyzovanými taxony o skutečných rozdílech v obsahu jaderné DNA mezi analyzovanými taxony o reálné intermediaritě hovořit zatím nelze. Konkrétní výsledky shrnuje tabulka 6.4.4b. Hodnota 2C M. obovata se liší od M. tripetala jen o 4,21%, což není velký rozdíl (rozdíl hodnoty 2C křížence proti rodičovským druhům je 2,41% a 1,84%). Tento výsledek však bylo možno očekávat, protože studované druhy se neliší počtem a zřejmě ani velikostí chromozomů. Pro hypotézu, že studované taxony se skutečně liší velikostí genomu, svědčí vymezení extrémních hodnot 2C u každého taxonu (viz graf 6.4.4) a přibližná intermediarita křížence. Protože intermediarita obsahu jaderné DNA ani u konkrétního křížence konkrétních rodičovských rostlin se vždy neprojevuje (což je dáno nejen nepřesností měření, ale i způsobem dědičnosti), Trávníček 2004 (osobní sdělení), nelze ani v případě potvrzení intermediarity obsahu jaderné DNA u křížence jednoznačně rozhodovat o rozdílech na úrovni jednotlivých taxonů.

Kromě měření obsahu jaderné DNA jednotlivých taxonů byla některá měření zaměřena na konkrétní rostliny. Šlo o H1/1 rostoucí osaměle u cesty na Chotobuzi - obvykle neplodný jedinec (umělé opylení však s pozitivními výsledky) částečně schovaný v porostu vyšších dřevin. Neplodnost z karyologických příčin u ní není pravděpodobná. Dále šlo o rostlinu H 'divná malá' - mladá rostlina (možná F2 generace) s nápadně relativně většími listy rostoucí v blízkosti O3/1 a nakonec o rostlinu H7/31, která se při isoenzymové analýze lišila od ostatních rostlin zpravidla zcela jedinečným patternem, morfologicky se vyznačovala tvarově odlišnými listy, je neznámého původu, v roce 2003 uschla, naštěstí v roce 2004 obrazila z kořenového základu (proto 'divná obražená'). Odlišnosti ve velikosti genomu u těchto rostlin také nebyly prokázány (údaje byly v rámci naměřené variability křížence).

rostlina	index	CV Magnolia	2C	2C průměr r.	2C min/max u jedné r. [%]
T 5/1	1,311	2,80	4,142	4,112	1,57
	1,319	2,78	4,117
	1,332	4,25	4,077
T BZ	1,354	4,69	4,010	3,960	2,52
	1,389	6,10	3,909
	1,331	2,08	4,080
	1,299	1,87	4,180
T Kostelec	1,323	4,58	4,104	4,104	0
T VUKOZ	1,337	3,61	4,061	4,064	0,15
	1,335	5,10	4,067
	1,297	1,65	4,187
	1,290	2,38	4,209
O 3/1	1,373	3,14	3,955	3,955	1,31
	1,382	3,21	3,929
	1,364	3,87	3,981
O BZ	1,402	3,69	3,873	3,838	1,81
	1,428	5,34	3,803
	1,343	1,83	4,043
	1,369	1,29	3,966
O d3	1,380	4,60	3,935	3,853	4,17
	1,440	5,71	3,771
O g1	1,373	4,23	3,955	3,925	1,52
	1,394	5,06	3,895
O g2	1,391	5,07	3,904	3,872	1,64
	1,414	6,38	3,840
H 1/1	1,376	2,73	3,946	3,930	1,64
	1,373	3,64	3,955
	1,396	4,42	3,890
H 1/10	1,359	4,41	3,996	4,007	0,57
	1,351	3,39	4,019
H 5/15	1,377	3,22	3,943	3,966	2,53
	1,348	2,83	4,028
	1,383	3,80	3,926
H 7/11,1/5___	1,370	4,23	3,964	3,945	0,96
	1,383	4,30	3,926
H 7/5,7/9___	1,365	4,38	3,978	3,961	0,88
	1,377	4,05	3,943
H div. malá	1,374	3,03	3,952	3,910	2,07
	1,390	3,89	3,906
	1,403	5,01	3,870
H div. obraž.	1,428	4,39	3,803	3,867	3,70
	1,411	4,44	3,848
	1,375	3,72	3,949

Tabulka 6.4.4a - výsledky všech měřeních (Drobným písmem jsou uvedeny výsledné hodnoty měření na cytometru Partec CyFlow. Vlastní výpočty 2C vycházejí z nezaokrouhlených hodnot.).

Graf 6.4.4 - krabicové diagramy M. tripetala (T), M. obovata (O) a křížence (H) ukazující naměřené hodnoty 2C u těchto taxonů (atypičtí jedinci křížence 'divná' nebyly zahrnuti)
Tabulka 6.4.4b - vyhodnocení výsledků FCM

taxon	rostliny použité k měřením x počet jejich měření	2C min/max [%]	2C [pg]
M. tripetala	5/1x3; BZx2; Kost.x1; VUKOZx2	5,63	4,060
M. x pruhoniciana	1/1x3; 1/10x2; 5/15x3; 7/11,1/5,4/47,4/41,4/45x2; 7/5,7/9,7/10,1/12,1/8x2	3,43	3,962
M. obovata	3/1x3; BZx2; d3x2; g1x2; g2x2	5,28	3,889
H divná malá	x3	2,07	3,910
H divná obraž.	x3	3,70	3,866

Hodnota 2C min/max udává procentuální rozdíl mezi naměřenými hodnotami absolutního minima a maxima u daného taxonu.

7 Isoenzymová analýza
7.1 Úvod
Tento úvod vychází z prací Kirschner et al. (2000), Pospíšková, Vacková (1997), Šimek (2001).

Variabilita enzymů byla poprvé popsána koncem 50. let 20. století a od 60. let se metoda analýzy isoenzymů rozšířila v oblasti populační genetiky, vývojové biologie, taxonomie a šlechtění rostlin. Jedná se o jednu z nejstarších metod odhalujících variabilitu na molekulární úrovni a v době rozmachu DNA metod v její prospěch mluví především relativní jednoduchost, rychlost, cenová dostupnost a metodická rozpracovanost.

Isoenzymy jsou proteiny, které katalyzují v rostlinném těle stejnou chemickou reakci, ale díky rozdílům v primární struktuře molekul (různý počet aminokyselin, záměny některých aminokyselin lišících se nábojem, stupněm hydrofility a velikostí) se odlišují některou ze svých vlastností (důležitá je zejména změna náboje molekul /čím větší je náboj, tím rychleji se molekula pohybuje v elektrickém poli/ a změny ve velikosti a tvaru molekul /gel funguje jako molekulové síto/). Důsledkem je rozdílná elektroforetická pohyblivost, díky které můžeme rozdělit spektrum proteinů, kódovaných alelami příslušného genu. Jako isoenzymy chápeme proteiny, které se barví při téže detekci. Proteiny, které domigrovaly na gelu do stejné polohy a obarvily se jako proužek, považujeme za produkt jedné alely daného genu. Díky kodominantní expresi genů se skládá získaný isoenzymový profil z produktů všech alel daného lokusu. Pro správnou interpretaci je dále nutné znát kvartérní strukturu daného enzymu, jeho lokalizaci v buňce a omezení aktivity na určitou ontogenetickou nebo fenologickou fázi.

Elektroforetické dělení probíhá v různých typech nosného media, obvyklé jsou škrobové, polyakrylamidové a agarosové gely a celulosoacetátové membrány. Pro dělení enzymů se užívají především polyakrylamidové gelové elektroforézy (PAGE) a elektroforézy na škrobovém gelu (SGE).

Výsledné isoenzymové profily můžeme porovnávat mezi sebou jako fenotypové projevy nebo lze získaná data interpretovat jako alelické frekvence. Základním předpokladem pro vyhodnocování je představa, že rozdílná pohyblivost enzymů v elektrickém poli odráží rozdíly v kódujících genech. Protože neurčujeme genetickou variabilitu přímo z variability DNA, ale z variability jejích produktů, musíme počítat s určitým zkreslením.

Isoenzymové profily jsou často komplikovány přítomností sekundárních isoenzymů, které se liší molekulovou konformací, ale jsou to ve skutečnosti produkty stejné alely. Tvoří přídatné proužky s rozdílnou mobilitou, protože se liší v sekundární či terciérní struktuře (produkty různých posttranslačních úprav produktů genů) nebo vykazují různou termostabilitu. Dalším nebezpečím vedoucím ke zkreslení výsledků je degradace molekul činností proteáz. Proto probíhá izolace za nepřetržitého chlazení a vzorky nejsou vystavovány velkým změnám teplot.

Alely s potlačenou či nulovou aktivitou (nulové alely), mohou způsobit problémy při interpretaci, pokud nejsou rozpoznány. Absence jakýchkoliv proužků v dané dráze na gelu může znamenat projev homozygotního stavu nulových alel. V takovém případě je nutné potvrdit výskyt studiem dědičnosti a vyloučit tak možnost, že jde o degradovaný vzorek. Špatné identifikování nulových alel může vést k chybnému určení genotypu, protože heterozygoti s kódující alelou by byli označeni u monomerního enzymu za homozygoty s jedním proužkem.

Někdy se alelické produkty, kódované v různých lokusech, na gelu překrývají a profily jsou obtížně interpretovatelné (především pokud jsou polymorfické). Tyto lokusy lze separovat pozměněním elektroforetických podmínek (koncentrace pufrů, gelů a doba elektroforézy).

Isoenzymy, které jsou kódovány různými alelami stejného lokusu (tj. allozymy) jsou využívány pro stanovení úrovně heterozygozity, genetické diverzity a dalších ukazatelů vnitro- a mezipopulační variability, k identifikaci klonů, určování potenciálních rodičů, způsobu rozmnožování, vlivu prostředí na populace a v systematických studiích jsou odhalovány vztahy mezi taxony (např. doba divergence příbuzných druhů - Liriodendron chinense a L. tulipifera, Parks et Wendel 1990).

Fixované rozdíly mezi dvěma druhy v daném lokusu umožňují spolehlivé určení mezidruhových hybridů jako heterozygotů. Pokud je enzym kodován jen jedním genem v jednom lokusu, je na gelu jen jedna zóna aktivity. Při křížení homozygotních rodičů s různými alelami daného genu vznikne F1 generace, jejíž genotyp je heterozygotní. V případě monomerního enzymu najdeme na gelu dva proužky, z nichž každý je produktem jedné alely daného lokusu, v případě dimeru se funkční enzym může skládat z podjednotek třemi různými způsoby a na gelu najdeme tři proužky (dva homodimerické a jeden heterodimerický), v případě trimeru čtyři atd. V F2 generaci se při křížení hybridů vyštěpují jednak původní rodičovské homozygotní fenotypy, jednak fenotypy heterozygotní. Pokud je enzym kódován ve více než jednom lokusu (jednotlivé lokusy obvykle kódují enzymy funkční v různých kompartmentech buňky nebo jsou lokusy duplikované v případě potřeby větší koncentrace enzymu v buňce), na gelu nalézáme více zón aktivity a také interpretace je složitější. Může docházet ke vzniku intergenických heterodimerů (při kombinaci podjednotek vzniklých přepisem genů v různých lokusech), jejichž zóna aktivity leží mezi produkty obou lokusů. Výše uvedené platí pro diploidní organizmy, u rostlin je poměrně často situace komplikovaná polyploidií.