Phosphatase-2 (shp-2) Region 2-Containing Protein Tyrosine Activation Via Recruitment of Src Homology kir2DL5 Can Inhibit Human nk cell

and SHP-2 (20). This result suggests that conjugation may be in-

hibited better by SHP-1 (or both phosphatases together) than by

SHP-2 alone.

The SAP-binding ITSM sequence has recently been described in

several human immunoreceptors, including 2B4, SLAM, CD84,

Ly-9, and NTB-A (32, 33). Although these CD2 family members

mainly exhibit activating functions, evidence indicates that en-

gagement of some of them can inhibit cell activation in the absence

of SAP expression. However, the exact consensus sequence of the

ITSM is not yet established, because another receptor, CRACC/

CSI, does not bind SAP despite the existence of two ITSM-like

sequences (44). Similarly, our experiments failed to detect SAP

binding to 3DL1/L5 by immunoprecipitation, and overexpression

of SAP did not affect the inhibitory function of 3DL1/L5 in NK-92

cells, indicating that SAP does not contribute to the unique inhib-

itory function of 2DL5. Another important incidental finding is

that we could not detect SHP-2 binding to 2B4 when it was phos-

phorylated in NK-92 cells (Fig. 5A). Although 2B4 has been

shown to bind SHP-2 in the absence of SAP in COS-7 or BaF3

cells (35, 45, 46), SHP-2 recruitment to 2B4 has never been dem-

onstrated in human NK cells, including primary human NK cells

(36, 37), YT cells (35), and NK-92 cells (Fig. 5A), or even in the

absence of SAP in NK cells derived from X-linked lymphoprolif-

erative disease patients (37).

The function of 2DL4 was originally thought to be inhibitory in

NK cells, because it has an ITIM in the cytoplasmic domain and

binds the nonclassical MHC-I molecule, HLA-G (47, 48). How-

ever, it has become apparent that 2DL4 is an activating receptor,

which strongly induces IFN-

␥ production when engaged (28–30).

In contrast, when only the cytoplasmic domain of 2DL4 was tested

in isolation, it inhibited NK cell cytotoxicity (30, 31). Because of

the high homology between the two members of the type II KIR

subfamily (79% amino acid identity) (49), 2DL5 and 2DL4, we

examined the inhibitory capacity of the full-length 2DL5 appended

with an N-terminal FLAG epitope tag in NK-92 cells. The full-

length 2DL5 suppressed cytotoxicity, demonstrating that 2DL5 is

an inhibitory receptor. Although we cannot exclude binding of

2DL5 to an activating accessory protein that is not expressed in

NK-92 cells, the absence of a charged amino acid in the 2DL5

transmembrane domain makes this possibility unlikely. Thus, ev-

idence indicates that 2DL5 is an inhibitory receptor, while 2DL4 is

an activating receptor within the type II KIR2D subgroup of hu-

man NK cells. The weak inhibitory capacity of the full-length

2DL5 compared with the chimera, 3DL1/L5, may be due to

weaker affinity of the FLAG-specific Ab compared with that of

DX9, anti-KIR3DL1 mAb. Alternatively, unique D0 –D2 struc-

tural orientations of 2DL4 and 2DL5 or mAb-binding orientation

of the N-FLAG motif may prevent optimal engagement in the

redirected cytotoxicity conjugates when compared with engage-

ment of the 3DL1 extracellular domain by DX9 mAb. In accor-

dance with our results, hemogglutinin-tagged 2DL4 with a muta-

tion in the transmembrane arginine demonstrated only weak

inhibition when engaged with anti-hemagglutinin-tag Ab (30).

Human NK cells use inhibitory lectin-like and Ig-like receptors,

including CD94/NKG2A and KIRs, to recognize MHC-I mole-

cules and block responses toward normal cells. CD94/NKG2A en-

gages with the nonclassical HLA-E, while the majority of KIR

family members are specific for subsets of HLA-A, -B, or -C al-

lotypes (50). KIR genes are differentially inherited among individ-

uals in the human population (51). A model for KIR gene expres-

sion has been proposed, in which two major expression profiles

were defined as A and B haplotypes. Individuals exhibiting the

group A haplotype have six KIR genes, including 2DL1, 2DL3,

3DL1, and 2DS4, while the group B KIR haplotypes are more

variable in their organization, including at least one additional

gene (51). Although the 2DL4 gene is present in almost all indi-

viduals and is reportedly transcribed in all NK cells, 2DL5 belongs

to the B haplotype and is clonally expressed by a subset of NK

cells in those individuals (22). It is tempting to speculate that the

2DL5 gene derives from 2DL4, because the exon-intron genomic

DNA organization of 2DL5 is similar to that of 2DL4 (49), they

share 79% amino acid homology, and they have the same config-

uration of extracellular Ig-like domains and a long cytoplasmic tail

(49). Furthermore, it is interesting that the C-terminal tyrosine in

the cytoplasmic domain of 2DL4 of pygmy chimpanzee, common

chimpanzee, and rhesus monkey is in the context of SxYxxL, sim-

ilar to the TxYxxL of 2DL5, suggesting related evolution and/or

functional importance. Our results demonstrate that the lack of the

charged transmembrane residue in 2DL5 allows it to function as an

inhibitory member of the type II KIR2D subfamily. Our data in

this report and our previous analysis of 2DL4 (31), however, dem-

onstrate that the atypical nature of or complete loss of the C-ter-

minal ITIM of type II KIR2D receptors establishes a SHP-2-se-

lective docking site. Thus, it is tempting to speculate that the

classical inhibitory KIRs, such as 3DL1, seems to have acquired

SHP-1-binding capacity to enhance or insure signaling in NK cells

that express both SHP-1 and SHP-2 when they obtained two typ-

ical ITIMs in the cytoplasmic domain. Whether KIRs use distinct

PTPs to inhibit different activation signaling pathways or whether

SHP-1 and SHP-2 have redundant roles in inhibition are still un-

known and await further analysis.

The ligand specificities of the type II KIR2D receptors remain to

be clarified. The ligand specificity of 2DL5 has not been reported

to date. Although two groups have reported that HLA-G serves as

a ligand for 2DL4 (47, 48, 52), two other groups have disputed this

ligand specificity (53, 54). Nonetheless, the type II KIR2D recep-

tors exhibit a unique Ig domain architecture (D0 and D2) that

borrows from the conserved Ig domains of the KIR3D subfamily

(possessing D0, D1, and D2), but is distinct from those of the type

I KIR2D subfamily (consisting of D1 and D2 domains). Because

D1 and D2 domains contribute the structural elements that recog-

nize the classical HLA-A, -B, and -C molecules (55–57), the

D0 –D2 orientation implies distinct ligand specificity for 2DL4 and

2DL5. Although it is unclear whether they recognize the same

ligand, our results demonstrate that 2DL5 transduces negative sig-

nals, while 2DL4 is an activating member of this type II KIR2D

subfamily.

Acknowledgments

We thank Drs. M. Colonna, C. Vilches, E. Long, B. Perussia, C. Lutz, and

G. Nolan for reagents. We also thank Drs. Glenn Rall, David Wiest, and

Akiko Kikuchi-Maki for critical reading of this manuscript and the following

research facilities at Fox Chase Cancer Center for reagents and technical sup-

port: DNA sequencing, DNA synthesis, cell culture, and cell sorting.

References

1. Trinchieri, G. 1989. Biology of natural killer cells. Adv. Immunol. 47:187.

2. Trinchieri, G. 1995. Natural killer cells wear different hats: effector cells of innate

resistance and regulatory cells of adaptive immunity and of hematopoiesis. Im-

munology 7:83.

3. Leibson, P. J. 1997. Signal transduction during natural killer cell activation: in-

side the mind of a killer. Immunity 6:655.

4. Yokoyama, W. M., and B. F. M. Plougastel. 2003. Immune functions encoded by

the natural killer gene complex. Nat. Immunol. 3:304.

5. Cerwenka, A., and L. L. Lanier. 2001. Natural killer cells, viruses and cancer.

Nat. Rev. Immunol. 1:41.

6. Long, E. O. 1999. Regulation of immune responses through inhibitory receptors.

Annu. Rev. Immunol. 17:875.

7. Burshtyn, D. N., and E. O. Long. 1997. Regulation through inhibitory receptors:

lessons from natural killer cells. Trends Cell Biol. 7:473.

8. Binstadt, B. A., K. M. Brumbaugh, C. J. Dick, A. M. Scharenberg,

B. L. Williams, M. Colonna, L. L. Lanier, J.-P. Kinet, R. T. Abraham, and

7391

The Journal of Immunology

 by guest on March 14, 2018

http://www.jimmunol.org/

Downloaded from 

---

P. J. Leibson. 1996. Sequential involvement of Lck and SHP-1 with MHC-rec-

ognizing receptors on NK cells inhibits FcR-initiated tyrosine kinase activation.

Immunity 5:629.

9. Burshtyn, D. N., A. M. Scharenberg, N. Wagtmann, S. Rajogopalan, K. Berrada,

T. Yi, J.-P. Kinet, and E. O. Long. 1996. Recruitment of tyrosine phosphatase

HCP by the killer cell inhibitory receptor. Immunity 4:77.

10. Burshtyn, D. N., J. Shin, C. Stebbins, and E. O. Long. 2000. Adhesion to target

cells is disrupted by the killer cell inhibitory receptor. Curr. Biol. 10:777.

11. Renard, V., A. Cambiaggi, F. Vely, M. Blery, L. Olcese, S. Olivero, M. Bouchet,

and E. Vivier. 1997. Transduction of cytotoxic signals in natural killer cells: a

general model of fine tuning between activatory and inhibitory pathways in lym-

phocytes. Immunol. Rev. 155:205.

12. Long, E. O., D. F. Barber, D. N. Burshtyn, M. Faure, M. Peterson,

S. Rajagopalan, V. Renard, M. Sandusky, C. C. Stebbins, N. Wagtmann, and

C. Watzl. 2001. Inhibition of natural killer cell activation signals by killer cell

immunoglobulin-like receptors (CD158). Immunol. Rev. 181:223.

13. Burshtyn, D. N., W. Yang, T. Yi, and E. O. Long. 1997. A novel phosphotyrosine

motif with a critical amino acid at position-2 for the SH2 domain-mediated ac-

tivation of the tyrosine phosphatase SHP-1. J. Biol. Chem. 272:13066.

14. Campbell, K. S., M. Dessing, M. Lopez-Botet, M. Cella, and M. Colonna. 1996.

Tyrosine phosphorylation of a human killer inhibitory receptor recruits protein

tyrosine phosphatase 1C. J. Exp. Med. 184:93.

15. Olcese, L., P. Lang, F. Ve´ly, A. Cambiaggi, D. Marguet, M. Ble´ry, K. L. Hippen,

R. Biassoni, A. Moretta, L. Moretta, et al. 1996. Human and mouse killer-cell

inhibitory receptors recruit PTP1C and PTP1D protein tyrosine phosphatases.

J. Immunol. 156:4531.

16. Fry, A. M., L. L. Lanier, and A. Weiss. 1996. Phosphotyrosines in the killer cell

inhibitory receptor motif of NKB1 are required for negative signaling and for

association with protein tyrosine phosphatase 1C. J. Exp. Med. 184:295.

17. Vely, F., S. Olivero, L. Olcese, A. Moretta, J. E. Damen, L. Liu, G. Krystal,

J. C. Cambier, M. Daeron, and E. Vivier. 1997. Differential association of phos-

phatases with hematopoietic co-receptors bearing immunoreceptor tyrosine-based

inhibition motifs. Eur. J. Immunol. 27:1994.

18. Burshtyn, D. N., A. S. Lam, M. Weston, N. Gupta, P. A. M. Warmerdam, and

E. O. Long. 1999. Conserved residues amino-terminal of cytoplasmic tyrosines

contribute to the SHP-1 mediated inhibitory function of killer cell Ig-like recep-

tors. J. Immunol. 162:897.

19. Vyas, Y. M., K. M. Mehta, M. Morgan, H. Maniar, L. Butros, S. Jung,

J. K. Burkhardt, and B. DuPont. 2001. Spatial organization of signal transduction

molecules in the NK cell immune synapses during MHC class I-regulated non-

cytolytic and cytolytic interactions. J. Immunol. 167:4358.

20. Yusa, S., and K. S. Campbell. 2003. Src homology region 2-containing protein

tyrosine phosphatase-2 (SHP-2) can play a direct role in the inhibitory function

of killer cell Ig-like receptors in human NK cells. J. Immunol. 170:4539.

21. Wilson, M. J., M. Torkar, A. Haude, S. Milne, T. Jones, D. Sheer, S. Beck, and

J. Trowsdale. 2000. Plasticity in the organization and sequences of human KIR/

ILT gene families. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:4778.

22. Vilches, C., C. M. Gardiner, and P. Parham. 2000. Gene structure and promoter

variation of expressed and nonexpressed variants of the KIR2DL5 gene. J. Im-

munol. 165:6416.

23. Gomez-Lozano, N., R. de Pablo, S. Puente, and C. Vilches. 2003. Recognition of

HLA-G by the NK cell receptor KIR2DL4 is not essential for human reproduc-

tion. Eur. J. Immunol. 33:639.

24. Khakoo, S. I., R. Rajalingam, B. P. Shum, K. Weidenbach, L. Flodin, D. G. Muir,

F. Canavez, S. L. Cooper, N. M. Valiante, L. L. Lanier, and P. Parham. 2000.

Rapid evolution of NK cell receptor systems demonstrated by comparison of

chimpanzees and humans. Immunity 12:687.

25. Rajalingam, R., M. Hong, E. J. Adams, B. P. Shum, L. A. Guethlein, and

P. Parham. 2001. Short KIR haplotypes in pygmy chimpanzee (Bonobo) resem-

ble the conserved framework of diverse human KIR haplotypes. J. Exp. Med.

193:135.

26. Hershberger, K. L., R. Shyam, A. Miura, and N. L. Letvin. 2001. Diversity of the

killer cell Ig-like receptors of rhesus monkeys. J. Immunol. 166:4380.

27. Loke, Y. W., and A. King. 1997. Immunology of human placental implantation:

clinical implications of our current understanding. Mol. Med. Today 3:153.

28. Kikuchi-Maki, A., S. Yusa, T. L. Catina, and K. S. Campbell. 2003. KIR2DL4 is

an IL-2 regulated NK cell receptor that exhibits limited expression in humans but

triggers strong IFN

␥ production. J. Immunol. 171:3415.

29. Rajagopalan, S., J. Fu, and E. O. Long. 2001. Cutting edge: induction of IFN-

␥

production but not cytotoxicity by the killer cell Ig-like receptor KIR2DL4

(CD158d) in resting NK cells. J. Immunol. 167:1877.

30. Faure, M., and E. O. Long. 2002. KIR2DL4 (CD158d), an NK cell-activating

receptor with inhibitory potential. J. Immunol. 168:6208.

31. Yusa, S., T. L. Catina, and K. S. Campbell. 2002. SHP-1- and phosphotyrosine-

independent inhibitory signaling by a killer cell Ig-like receptor cytoplasmic do-

main in human NK cells. J. Immunol. 168:5047.

32. Sayos, J., M. Martin, A. Chen, M. Simarro, D. Howie, M. Morra, P. Engel, and

C. Terhorst. 2001. Cell surface receptors Ly-9 and CD84 recruit the X-linked

lymphoproliferative disease gene product SAP. Blood 97:3867.

33. Howie, D., M. Simarro, J. Sayos, M. Guirado, J. Sancho, and C. Terhorst. 2002.

Molecular dissection of the signaling and costimulatory functions of CD150

(SLAM): CD150/SAP binding and CD150-mediated costimulation. Blood

99:957.

34. Sayos, J., C. Wu, M. Morra, N. Wang, X. Zhang, D. Allen, S. van Schaik,

L. Notarangelo, R. Geha, M. G. Roncarolo, et al. 1998. The X-linked lympho-

proliferative-disease gene product SAP regulates signals induced through the

co-receptor SLAM. Nature 395:462.

35. Sayos, J., K. B. Nguyen, C. Wu, S. E. Stepp, D. Howie, J. D. Schatzle, V. Kumar,

C. A. Biron, and C. Terhorst. 2000. Potential pathways for regulation of NK and

T cell responses: differential X-linked lymphoproliferative syndrome gene prod-

uct SAP interactions with SLAM and 2B4. Int. Immunol. 12:1749.

36. Bottino, C., M. Falco, S. Parolini, E. Marcenaro, R. Augugliaro, S. Sivori,

E. Landi, R. Biassoni, L. D. Notarangelo, L. Moretta, and A. Moretta. 2001.

NTB-A [correction of GNTB-A], a novel SH2D1A-associated surface molecule

contributing to the inability of natural killer cells to kill Epstein-Barr virus-in-

fected B cells in X-linked lymphoproliferative disease. J. Exp. Med. 194:235.

37. Parolini, S., C. Bottino, M. Falco, R. Augugliaro, S. Giliani, R. Franceschini,

H. D. Ochs, H. Wolf, J. Y. Bonnefoy, R. Biassoni, et al. 2000. X-linked lym-

phoproliferative disease: 2B4 molecules displaying inhibitory rather than acti-

vating function are responsible for the inability of natural killer cells to kill

Epstein-Barr virus-infected cells. J. Exp. Med. 192:337.

38. Kinsella, T. M., and G. P. Nolan. 1996. Episomal vectors rapidly and stably

produce high-titer recombinant retrovirus. Hum. Gene Ther. 7:1405.

39. Moss, B., and P. L. Earl. 1998. Expression of proteins in mammalian cells using

vaccinia viral vectors. In Current Protcol in Molecular Biology, Vol. 3.

F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J. G. Seidman,

J. A. Smith, and K. Struhl, eds. Wiley, New York, p. 16.15.1.

40. Rajagopalan, S., and E. O. Long. 2000. Use of vaccinia virus for functional gene

transfer in natural killer cells. In Natural Killer Cell Protocols: Cellular and Molec-

ular Methods, Methods in Molecular Biology, Vol. 121. K. S. Campbell and M.

Colonna, eds. Humana, Totowa, NJ, p. 265.

41. Gupta, N., A. M. Scharenberg, D. N. Burshtyn, N. Wagtmann, M. N. Lioubin,

L. R. Rohrschneider, J. P. Kinet, and E. O. Long. 1997. Negative signaling path-

ways of the killer cell inhibitory receptor and Fc

␥RIIb1 require distinct phos-

phatases. J. Exp. Med. 186:473.

42. Binstadt, B. A., D. D. Billadeau, D. Jevremovic, B. L. Williams, N. Fang, T. Yi,

G. A. Koretzky, R. T. Abraham, and P. J. Leibson. 1998. SLP-76 is a direct

substrate of SHP-1 recruited to killer cell inhibitory receptors. J. Biol. Chem.

273:27518.

43. Bruhns, P., P. Marchetti, W. H. Fridman, E. Vivier, and M. Dae¨ron. 1999. Dif-

ferential roles of N- and C-terminal immunoreceptor tyrosine-based inhibition

motifs during inhibition of cell activation by killer cell inhibitory receptors. J. Im-

munol. 162:3168.

44. Bouchon, A., M. Cella, H. L. Grierson, J. I. Cohen, and M. Colonna. 2001.

Activation of NK cell-mediated cytotoxicity by a SAP-independent receptor of

the CD2 family. J. Immunol. 167:5517.

45. Tangye, S. G., S. Lazetic, E. Woollatt, G. R. Sutherland, L. L. Lanier, and

J. H. Phillips. 1999. Cutting edge: human 2B4, an activating NK cell receptor,

recruits the protein tyrosine phosphatase SHP-2 and the adaptor signaling protein

SAP. J. Immunol. 162:6981.

46. Morra, M., J. Lu, F. Poy, M. Martin, J. Sayos, S. Calpe, C. Gullo, D. Howie,

S. Rietdijk, A. Thompson, et al. 2001. Structural basis for the interaction of the

free SH2 domain EAT-2 with SLAM receptors in hematopoietic cells. EMBO J.

20:5840.

47. Rajagopalan, S., and E. O. Long. 1999. A human histocompatibility leukocyte

antigen (HLA)-G-specific receptor expressed on all natural killer cells. J. Exp.

Med. 189:1093.

48. Ponte, M., C. Cantoni, R. Biassoni, A. Tradori-Cappai, G. Bentivoglio, C. Vitale,

S. Bertone, A. Moretta, L. Moretta, and M. C. Mingari. 1999. Inhibitory receptors

sensing HLA-G1 molecules in pregnancy: decidua-associated natural killer cells

express LIR-1 and CD94/NKG2A and acquire p49, an HLA-G1-specific receptor.

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:5674.

49. Vilches, C., R. Rajalingam, M. Uhrberg, C. M. Gardiner, N. T. Young, and

P. Parham. 2000. KIR2DL5, a novel killer-cell receptor wth a D0D2 configura-

tion of Ig-like domains. J. Immunol. 164:5797.

50. Vilches, C., and P. Parham. 2002. KIR: diverse, rapidly evolving receptors of

innate and adaptive immunity. Annu. Rev. Immunol. 20:217.

51. Uhrberg, M., N. M. Valiante, B. P. Shum, H. G. Shilling, K. Lienert-Weidenbach,

B. Corliss, D. Tyan, L. L. Lanier, and P. Parham. 1997. Human diversity in killer

cell inhibitory receptor genes. Immunity 7:753.

52. Cantoni, C., S. Verdiani, M. Falco, A. Pessino, M. Cilli, R. Conte, D. Pende,

M. Ponte, M. S. Mikaelsson, L. Moretta, and R. Biassoni. 1998. p49, a putative

HLA class I-specific inhibitory NK receptor belonging to the immunoglobulin

superfamily. Eur. J. Immunol. 28:1980.

53. Allan, D. S., M. Colonna, L. L. Lanier, T. D. Churakova, J. S. Abrams,

S. A. Ellis, A. J. McMichael, and V. M. Braud. 1999. Tetrameric complexes of

human histocompatibility leukocyte antigen (HLA)-G bind to peripheral blood

myelomonocytic cells. J. Exp. Med. 189:1149.

54. Boyson, J. E., R. Erskine, M. C. Whitman, M. Chiu, J. M. Lau, L. A. Koopman,

M. M. Valter, P. Angelisova, V. Horejsi, and J. L. Strominger. 2002. Disulfide

bond-mediated dimerization of HLA-G on the cell surface. Proc. Natl. Acad. Sci.

USA 99:16180.

55. Boyington, J. C., S. A. Motyka, P. Schuck, A. G. Brooks, and P. D. Sun. 2000.

Crystal structure of an NK cell immunoglobulin-like receptor in complex with its

class I MHC ligand. Nature 405:537.

56. Fan, Q. R., E. O. Long, and D. C. Wiley. 2001. Crystal structure of the human

natural killer cell inhibitory receptor KIR2DL1-HLA-Cw4 complex. Nat. Immu-

nol. 2:452.

57. Khakoo, S. I., R. Geller, S. Shin, J. A. Jenkins, and P. Parham. 2002. The D0

domain of KIR3D acts as a major histocompatibility complex class I binding

enhancer. J. Exp. Med. 196:911.

7392

KIR2DL5 IS AN INHIBITORY RECEPTOR

 by guest on March 14, 2018

http://www.jimmunol.org/

Downloaded from