Phosphatase-2 (shp-2) Region 2-Containing Protein Tyrosine Activation Via Recruitment of Src Homology kir2DL5 Can Inhibit Human nk cell

KIR family, belonging to the type II KIR2D subgroup, which con-

tains one other member named KIR2DL4 (2DL4) (21, 22).

KIR2DL5 is structurally related to 2DL4, showing 79% amino

acid sequence homology. Both receptors have a distinct configu-

ration of extracellular Ig-like domains (D0 –D2) and a longer cy-

toplasmic tail than that of classical type I inhibitory KIRs.

KIR2DL5 has two tyrosines in the cytoplasmic domain, no

charged amino acids in the transmembrane domain, and is found in

50% of all humans, while 2DL4 is the only long KIR that has a

single cytoplasmic tyrosine, a positively charged transmembrane

arginine, and is encoded by a gene found in virtually all individuals

(22, 23). Interestingly, both 2DL5 and 2DL4 are highly conserved

among rhesus monkeys, chimpanzees, and humans, suggesting

their physiological importance in NK cell functions (24 –26). The

ligand of 2DL4 is thought to be the nonclassical class I MHC

molecule, HLA-G, which is normally expressed only on fetally

derived trophoblast cells that invade the maternal decidua in preg-

nant women (27). In contrast, the ligand specificity and function of

2DL5 have not been addressed to date, although the structural

similarities with 2DL4 suggest similar ligand recognition patterns.

Despite the cytoplasmic ITIM, 2DL4 was shown to function as an

activating receptor to selectively produce IFN-

␥, apparently

through association with an undefined transmembrane accessory

protein (28, 29). Interestingly, mutation of the charged residue in

the transmembrane domain of 2DL4 converted it from an activat-

ing to an inhibitory receptor, probably due to dissociation from the

putative activating accessory signaling protein (30). In addition,

the cytoplasmic domain of 2DL4 was shown to inhibit NK cell

cytotoxicity when fused with extracellular and transmembrane do-

mains of KIR3DL1 (3DL1), which appears to be due to exclusive

recruitment of SHP-2, but not SHP-1 (31). These results suggest

that 2DL4 may play both activating and inhibitory roles in NK cell

biology, although only activating function has been demonstrated

for the full-length wild-type receptor, which is not hindered by the

cytoplasmic ITIM (28 –30). The function of 2DL5, however, has

not been tested.

The two tyrosine-based sequences in the cytoplasmic domain of

2DL5 are characteristic of a classical N-terminal ITIM and another

sequence similar to the immunoreceptor tyrosine-based switch mo-

tif (ITSM; T/SxYxxV/I). The ITSM sequence has been shown to

exist in several human immunoreceptors, including 2B4, signaling

lymphocyte activation molecule (SLAM), CD84, and Ly-9 (32,

33), and has been shown to recruit both the SLAM-associated pro-

tein (SAP) (otherwise known as SH2-containing adapter protein

1A (SH2D1A)) and SHP-2 (34, 35). Although 2B4 recruits both

proteins when expressed in nonlymphoid cells, all published ex-

periments have failed to detect SHP-2 binding to 2B4 in NK cells

(35, 36), even in the absence of SAP (37). Because SHP-2 is also

involved in KIR function, it is of interest to determine whether the

ITSM-like sequence of 2DL5 affects SHP-2 recruitment and in-

hibitory function of the receptor in human NK cells.

In this study, we directly compared the inhibitory function and

PTP recruitment capacities of the cytoplasmic domains of the clas-

sical KIR, 3DL1, with 2DL5 and 2DL4 using a chimeric receptor

approach. We defined the importance of two ITIM sequences for

optimal KIR inhibition, because 2DL5 inhibition seems to be

weaker than that of 3DL1. Our results indicate that 2DL5 functions

as an inhibitory receptor, sharing similar inhibitory capacity with

that of the cytoplasmic domain of 2DL4. Using cytotoxicity and

conjugate formation assays and DN forms of phosphatases, we

demonstrate that different inhibitory KIRs have qualitatively dis-

tinct inhibitory capacities, which cannot be entirely predicted from

a strictly biochemical approach.

Materials and Methods

Cell culture and Abs

The IL-2-dependent NK-like cell line, NK-92 (a gift from C. Lutz, Uni-

versity of Iowa, Iowa City, IA), was cultured, as previously described (31).

Cells were passed with fresh IL-2 every 4 days. The murine mastocytoma,

P815, was cultured, as previously described (31). Abs were purified with

protein G from the hybridomas for the anti-3DL1 mAb, DX9, and the

anti-CD56 mAb, B159.5.2, which were kindly provided by L. Lanier (Uni-

versity of California, San Francisco, CA) and B. Perussia (Thomas Jeffer-

son University, Philadelphia, PA), respectively. The anti-FLAG mAb, M2,

was purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Anti-SAP polyclonal

Abs raised against the entire recombinant protein were obtained from Ex-

alpha (Boston, MA).

cDNA constructs

KIR cDNA constructs were ligated into the retroviral expression vector,

pBMN-NoGFP (green fluorescence protein), derived from pBMN-IRES-

EGFP (enhanced green fluorescence protein) (38), using BamHI, XhoI, and

NotI restriction sites, as previously described (31). The 3DL1 cDNA

(NKAT3; GenBank accession number, L41269) was obtained from M.

Colonna (Washington University, St. Louis, MO). The deletion mutant of

3DL1 (272P

⌬), which was truncated before the first ITIM and lacks most

of the cytoplasmic domain, was described previously (31). To generate the

chimeric 3DL1/L5 receptor, the cytoplasmic domain was amplified by PCR

from the human 2DL5.1 cDNA (AF204903), kindly provided by C.

Vilches (Inmunologia, Hospital Universitario Puerta de Hierro, Madrid,

Spain) and cloned into the pCR2.1-TOPO vector (Invitrogen, San Diego,

CA) using the following primers: sense containing BspHI site (underlined),

5

Ј-CT GCT GTC ATG AAC CAA GAG CCT GC-3Ј; antisense containing

XhoI site, 5

Ј-ACT GTA CTC GAG GCT AAG CAA AGG AGT GTG

TC-3

Ј. The extracellular and transmembrane domains of 3DL1 were am-

plified by PCR using the sense primer (BamHI), 5

Ј-TCG ACT GGA TCC

ACC ATG TCG CTC ATG GTC GTC AGC ATG-3

Ј, and the antisense

primer (BspHI), 5

Ј-AGG CTC TTG GTT CAT GAC AGC AGC AT-3Ј.

The BamHI-BspHI fragment of 3DL1 and the BspHI-XhoI fragment of

2DL5 were cloned into the pBMN-NoGFP vector. The ITIM tyrosine in the

2DL5 cytoplasmic domain was mutated to phenylalanine by PCR using the

sense primer, 5

Ј-CT CAG GAG GTG ACA TTT GCA CAG TTG GAT

CAC-3

Ј, and the antisense primer, 5Ј-GTG ATC CAA CTG TGC AAA

TGT CAC CTC CTG AG-3

Ј. To make FLAG-tagged full-length

KIR2DL5, the cDNA was amplified by PCR using the sense primer

(EcoRI), 5

Ј-AT CGT ACG AAT TCA CAT GAG GGT GGT CAG GA-3Ј,

and the antisense primer (NotI), 5

Ј-ATGCAG CGG CCG CTC AGA TTC

CAG CTG CTG GTA-3

Ј. The EcoRI-EcoRI fragment containing a leader

peptide and N-terminal FLAG epitope tag (DYKDDDK) was cloned from

the pFLAG-CMV3 vector (Sigma-Aldrich). The EcoRI-NotI fragment of

2DL5.1 and EcoRI-EcoRI fragment of the leader plus FLAG sequences

were cloned into the pBMN-IRES-EGFP vector. SAP was amplified by

PCR from a Jurkat cDNA library using the sense primer (SalI), 5

Ј-AC-

GACA GTC GAC GAT GGA CGC AGT GGC TGT-3

Ј, and the antisense

primer containing Myc-tag (NotI), 5

Ј-ACG ACA GCG GCC GCT AAA

GAT CTT CTT CAG AAA TAA GTT TCT GTT CTG GGG CTT TCA

GGC AGA-3

Ј. The SalI-NotI fragment of SAP was cloned into the pBMN-

IRES-EGFP vector. All PCR was performed using Platinum Pfx DNA

polymerase (Life Technologies, Rockville, MD), and the integrity of all

constructs was confirmed by automated sequencing in the Fox Chase Can-

cer Center DNA sequence facility.

Retroviral transduction into NK-92 cell line

The retrovirus-mediated transduction was performed, as previously de-

scribed (20). The transduced NK cells were sorted for expression of either

GFP or 3DL1 using the 3DL1-specific PE-conjugated DX9 mAb (BD

PharMingen, San Diego, CA) in the Fox Chase Cancer Center Cell Sorting

Facility. These sorted cells stably expressed the receptors for at least 1 mo.

Uniform exogenous 3DL1 expression in

Ͼ98% of the transduced cell pop-

ulation was confirmed at the time of every experiment using PE-conjugated

DX9 mAb by flow cytometric analysis on a FACScan analyzer (BD Bio-

sciences, Mountain View, CA). SAP and 3DL1 were coexpressed in se-

quentially transduced NK-92 cells by sorting for EGFP and DX9-PE stain-

ing, respectively.

Redirected cytotoxicity assay

NK-92 cells were cultured with fresh IL-2-containing medium on the day

before assay, and redirected cytolytic activity was tested against the

Fc

␥RII/III

ϩ

P815 murine mastocytoma cell line in a 4-h

51

Cr release assay,

as previously described (31). HLA-B*2702-expressing 721.221 cells could

7386

KIR2DL5 IS AN INHIBITORY RECEPTOR

 by guest on March 14, 2018

http://www.jimmunol.org/

Downloaded from 

---