Phosphatase-2 (shp-2) Region 2-Containing Protein Tyrosine Activation Via Recruitment of Src Homology kir2DL5 Can Inhibit Human nk cell

Pervanadate treatment stimulated robust tyrosine phosphorylation

of both receptors (Fig. 3, upper left panel). Interestingly, the ty-

rosine-phosphorylated 3DL1/L5 chimera coimmunoprecipitated

both SHP-1 and SHP-2 (left panels in Fig. 3), even though the

inhibition of conjugate formation by 3DL1/L5 was weaker than

that of 3DL1. As previously shown, both SHP-1 and SHP-2 were

coimmunoprecipitated with tyrosine-phosphorylated 3DL1 (left

panels in Fig. 3), while control CD56 immunoprecipitates did not

bind either PTP (right panels). In contrast, we were unable to

detect the recruitment of either PTP to the phosphorylated mutant

3DL1/L5.FY receptor (data not shown), indicating that binding

depends upon the membrane-proximal ITIM sequence. We also

tested whether these phosphorylated receptors could recruit other

effector enzymes that have potential inhibitory function and an

SH2 domain to bind phosphorylated ITIMs. Neither Csk (COOH-

terminal Src kinase) nor SHIP was detectably recruited to phos-

phorylated forms of either 3DL1 or 3DL1/L5 in NK-92 cells (data

not shown). These results suggest that 2DL5 inhibits NK cell ac-

tivation through the PTP-mediated inhibitory pathway, like other

classical KIRs possessing two canonical ITIMs.

DN-SHP-2 blocks inhibition of natural cytotoxicity by 3DL1/L5

To directly address the functional importance of either SHP-1 or

SHP-2 in 3DL1/L5-mediated inhibition, we next tested whether

expression of DN forms of the PTPs (catalytically inactive) could

abolish KIR inhibitory function. Vaccinia virus-mediated expres-

sion of either DN-SHP-1 or DN-SHP-2 has been shown to block

inhibition through classical KIRs, including 3DL1, which provides

convincing evidence for involvement of both PTPs in this process

(8, 9, 41, 42). Although SHP-1 and SHP-2 were both able to bind

the cytoplasmic domain of 2DL5 (as was true for 3DL1), our con-

jugate formation study indicated that the inhibitory capacity of

3DL1/L5 was similar to that of 3DL1/L4 (SHP-2-only binding)

(31). Therefore, we compared the impacts of treating NK-92 cells

with recombinant vaccinia virus preparations expressing DN-

SHP-1, wild-type SHP-1, or DN-SHP-2 on 3DL1/L5 inhibitory

function. Receptor-transduced NK-92 cells were infected with pu-

rified vaccinia preparations at PFU titers that produced robust lev-

els of the exogenous PTP (10- to 50-fold above endogenous) (20,

31) (data not shown). These doses of vaccinia expressing both

DN-SHP-1 and DN-SHP-2 routinely block 3DL1 inhibitory func-

tion in our hands (20, 31). In a redirected cytotoxicity assay against

P815 target cells, inhibition through 3DL1/L5 was virtually un-

changed by expression of wild-type SHP-1 (Fig. 4). In contrast,

expression of DN-SHP-2 completely abrogated wild-type 3DL1-

mediated inhibition (Fig. 4), providing evidence that SHP-2 is di-

rectly recruited to KIR2DL5 during inhibitory signaling in vivo.

Interestingly, DN-SHP-1 did not effectively block the inhibition by

3DL1/L5 (Fig. 4), even though our biochemical studies showed

that SHP-1 could bind to 3DL1/L5 (Fig. 3). These results indicate

that 2DL5 inhibition of NK cell activation is more dependent upon

SHP-2 than SHP-1. This is an intriguing observation, indicating

that the phosphorylated tyrosine-based motifs of 3DL1/L5 create a

docking site that dominantly recruits SHP-2 to mediate inhibition.

FIGURE 1.

Map of gene constructs

used in these studies and establishment of

stable transduced NK cell lines. A, Sche-

matic representations of the various chi-

meric constructs between 3DL1 (

Ⅺ) and

2DL5 ( ) that were generated. D0, D1,

and D2 are highly conserved Ig-like do-

mains in the KIR family. TM and CY

represent transmembrane and cyto-

plasmic domains, respectively. Tyro-

sine-based ITIM motifs (VTYAQL

ϩ

ILYTEL) and ITSM-like sequence of

2DL5 (TMYMEL) are marked in the

cytoplasmic domains. 3DL1/L4, which

contains only the N-terminal ITIM, and

3DL1/272P

⌬, which does not contain

any cytoplasmic tyrosine, were previously

described (31). These genes were intro-

duced into a retrovirus-based plasmid

vector, pBMN-NoGFP. B, Flow cytomet-

ric analysis of 3DL1-positive transduced

cells. The 3DL1-negative NK cell line,

NK-92, was introduced with the con-

structs shown as in A by retroviral trans-

duction. The data show staining for 3DL1

with PE-labeled DX9 mAb (filled lines)

and background staining of the 3DL1-

negative parent cell line (dashed lines). C,

Amino acid sequence of the cytoplasmic

domains of the KIR constructs. The 3DL1

and 2DL5 were fused at the common me-

thionine in the cytoplasmic domain by in-

troducing a BspHI restriction site (under-

lined), which encodes the amino acids

VMN. The dots indicate identity to the

3DL1/L5 chimera sequence. Bolded se-

quences represent the positions of ITIM-

and ITSM-like sequences.

7388

KIR2DL5 IS AN INHIBITORY RECEPTOR

 by guest on March 14, 2018

http://www.jimmunol.org/

Downloaded from 

---

The ITSM-like sequence of 2DL5 does not bind SAP

Because the cytoplasmic domain of 2DL5 contains an ITSM-like

sequence, which is a known docking site for both SHP-2 and SAP,

we next tested whether SAP binds to phosphorylated 3DL1/L5 or

influences the role of SHP-2 in 2DL5 function. First, 3DL1/L5 and

2B4 were immunoprecipitated from pervanadate-treated NK-92

cells and tested for SHP-2 and SAP recruitment by immunoblot-

ting. Pervanadate treatment stimulated robust tyrosine phosphory-

lation of 3DL1/L5 and 2B4 (Fig. 5A). Immunoprecipitates of ty-

rosine-phosphorylated 3DL1/L5 coprecipitated SHP-2, but SAP

binding was not detected (Fig. 5A). Importantly, SAP was also not

detected in immunoprecipitates of the phosphorylated mutant

3DL1/L5.FY receptor, in which only the ITSM-like tyrosine is

intact (data not shown). In contrast, tyrosine-phosphorylated 2B4

coimmunoprecipitated SAP, but not SHP-2 (Fig. 5A), as previ-

ously described (35, 36). Control CD56 immunoprecipitates did

not contain either protein (Fig. 5A).

We next tested whether overexpression of exogenous SAP could

influence the inhibitory function of 3DL1/L5. In these experi-

ments, SAP was overexpressed at levels of 5- to 10-fold above

Table I. Statistical analysis of the capacities of mutant KIR3DL1

receptors to inhibit cytotoxicity

a

Receptors

No. of

Experiments

Mean Percentage of Control Cytotoxicity

when Engaged with anti-KIR3DL1

(

ϩSD)

3DL1

4

26.9 (12.5)*

3DL1/L5

6

34.9 (8.8)*

3DL1/L4

4

43.3 (10.8)*

3DL1/272P

⌬

4

99.5 (6.2)

a

Statistical analysis was performed on cytotoxicity data from multiple experi-

ments by converting the data at 10:1 E:T ratio within each experiment to percentage

of control cytotoxicity (without Ab). Within each experiment, the duplicate or trip-

licate data points in the absence of Ab of each cell line were averaged, and the average

was designated 100% of control cytotoxicity. Every data point for each transduced

cell line within each experiment was converted to percentage of control cytotoxicity

(SD ranged from 2.8 to 4.4), and Student’s t test was performed to compare the

aggregate data points from Ab-untreated and anti-KIR3DL1-treated conjugation con-

ditions for each transduced cell line. Statistical analysis was performed on the Excel

X program for Macintosh (Microsoft). *, p

Ͻ 0.05 compared with nontreated controls.

FIGURE 4.

KIR3DL1/L5 inhibition is blocked by expression of the DN

form of SHP-2, but not DN-SHP-1. Recombinant vaccinia virus prepara-

tions encoding either wild-type SHP-1 (10 PFU/cell; top right panel), DN-

SHP-1 (C453S, 10 PFU/cell; middle right panel), or DN-SHP-2 (C459S, 5

PFU/cell; bottom right panel) were used to infect 3DL1/L5-expressing

NK-92 cells. Aliquots of infected cells were used in a redirected cytotox-

icity assay in the presence of either anti-CD56 (B159.5.2; E) as a control

or anti-3DL1 (DX9; F) mAbs (1

␮g/ml). Results are representative of three

independent experiments.

FIGURE 2.

Inhibition of cytotoxicity and target cell conjugation by en-

gagement of 3DL1/L5. A, Redirected cytotoxicity assay using NK-92 cells

transduced with the receptors described in Fig. 1. The stable transduced NK-92

cells were tested for their abilities to lyse P815 targets in the absence of mAb

(E) or in the presence of 1

␮g/ml anti-3DL1 mAb (DX9; F) or the anti-CD56

mAb (B159.5.2; open cross) as a control. Results are representative of eight

independent experiments, showing identical patterns of inhibition. B, Conju-

gate formation using NK-92 cells described in A against P815 cells in the

absence of mAb (E) or in the presence of anti-3DL1 mAb at 1

␮g/ml (DX9;

F). Results are representative of four independent experiments. C, Redirected

cytotoxicity assay using NK-92 cells transduced with wild-type 3DL1 or the

mutant 3DL1/L5.FY receptor. Cytotoxicity of P815 target cells was performed

in the presence of anti-CD56 or anti-3DL1, as described for A above. Results

are representative of three independent experiments.

FIGURE 3.

Tyrosine-phosphorylated

3DL1/L5

binds

SHP-1

and

SHP-2. Receptor-transduced NK-92 cells were treated with pervanadate for

various times and lysed with 1% Triton X-100, and sequential immuno-

precipitates were prepared with anti-CD56 and then anti-3DL1 mAbs. Each

lane represents immunoprecipitation from a lysate of 40 million cells. Sam-

ples were analyzed on 10% SDS-PAGE gels under reducing conditions.

Sequential immunoblot analysis was performed with anti-phosphotyrosine,

anti-SHP-1, and anti-SHP-2.

7389

The Journal of Immunology

 by guest on March 14, 2018

http://www.jimmunol.org/

Downloaded from 

---