Stanovení na ISE modulech Společné stanovení Tři ISE elektrody, jedna referenční (argentchloridová elektroda ) Měří se rozdíl potenciálu mezi IS elektrodou a referenční elektrodou ISE elektroda měří aktivitu, přepočet na koncentraci pomocí aktivitního koeficientu Nepřímá a přímá potenciometrie
Analýza vzorku značně naředěného (např. 30x) diluentem o vysoké iontové síle Analýza vzorku značně naředěného (např. 30x) diluentem o vysoké iontové síle Generovaný elektrický potenciál porovnáván s potenciálem standardních roztoků – korekce na teplotu nebo elektrické nestability Koncentrace iontů se počítá podle Nerstovy rovnice
Výsledky odpovídají měření plamenovou emisní spektrofotometrií Výsledky odpovídají měření plamenovou emisní spektrofotometrií Chyba způsobená přítomností proteinů a lipidů v plasmě (7%) Naměřené hodnoty se počítají na celkový objem plasmy Např. koncentrace 145 mmol Na+/l bude ve vodné fázi (počítáme-li 93% vodné fáze) ve skutečnosti 156 mmol Na+/l Negativní chyba známa po řadu let
Jednotlivé ISE elektrody Jednotlivé ISE elektrody Elektrody integrované - integrovaná chipová technologie Na basi tenkovrstvé ionoforové technologie (ionofory umožňují transport iontů přes membránu) Makrocyklické ionofory - molekuly s dutinou, ve které jsou pevně vázané ionty - crown etery
Doporučená rutinní metoda: FAES (s Li spektrálním pufrem), ISE direct, ISE indirect Doporučená rutinní metoda: FAES (s Li spektrálním pufrem), ISE direct, ISE indirect Referenční metoda: ID-MS, FAES, IC (navržená) Hlavní extracelulární kationt – reprezentuje 90 % všech kationtů v plasmě Hraje centrální roli v distribuci vody Výrazně se podílí na osmotickém tlaku v extracelulární tekutině
Referenční rozmezí: S/P 136-145 mmol/l moč dospělí 70-270 mmol/24 hod děti do 1 roku 10-30 mmol/24 hod
Stanovení Na pomocí ISE: Stanovení Na pomocí ISE: skleněná sodíková elektroda nebo crown éterový případně crown malonátový ionofor integrovaný do iontověselektivní plastové membrány (PVC, teflon) Enzymatické stanovení Na (nedoporučuje se): Metoda založena na aktivaci enzymu b-galoktosidasy ionty sodíku Hydrolýza chromogenního substrátu 2 – nitrofenyl - b - D - galaktopyranosidu na galaktosu a 2-nitrofenol Rychlost hydrolýzy se měří kineticky při 420 nm
Excitované atomy Na emitují spektra s ostrou čarou při 768 nm Rutinně se již nepoužívá
Doporučená rutinní metoda: FAES (s Li spektrálním pufrem), ISE direct, ISE indirect Doporučená rutinní metoda: FAES (s Li spektrálním pufrem), ISE direct, ISE indirect Referenční metoda: ID-MS, FAES, IC (navržená) Hlavní intracelulární kationt - koncentrace v erytrocytech je 23x vyšší než v plasmě Vysoká koncentrace uvnitř buňek zajištěna pomalou difuzí přes buněčnou membránu ven Na+,K+ - ATPasová pumpa transportuje kalium do buněk proti koncentračnímu gradientu Interference: Hemolýza zvyšuje hodnoty draslíku
Referenční rozmezí: S/P 3,5-5,1 mmol/l moč dospělí 25-125 mmol/24 hod děti do 1 roku 15- 40 mmol/24 hod
Stanovení K pomocí ISE: Stanovení K pomocí ISE: PVC membrána, v ní zabudován valinomycin (na principu iontové výměny) Stanovení K plamenovou emisní spektrofotometrií: Excitované atomy K emitují spektra s ostrou čarou při 589 nm Rutinně se nepoužívá Enzymatické stanovení K: Metoda založena na aktivaci vhodného enzymu ionty draslíku Např. tryptofanasa se substrátem tryptofanem Metoda není doporučena
Doporučená rutinní metoda: Coulometrie, ISE direct, ISE indirect Doporučená rutinní metoda: Coulometrie, ISE direct, ISE indirect Referenční metoda: Coulometrie Hlavní extracelulární aniont - největší frakce anorganických aniontů v plasmě Zásadní role v normální distribuci vody Výrazný podíl na osmotickém tlaku v extracelulární tekutině
Referenční rozmezí: Referenční rozmezí: S/P 98-109 mmol/l moč dospělí 110-250 mmol/24 hod děti do 1 roku 3-10 mmol/24 hod
Stanovení Cl pomocí ISE: Stanovení Cl pomocí ISE: Polymerní membrána – v ní kvarterní amoniové soli Např. trioktylpropylamonium chlorid dekanol Membrána zajišťuje iontovou výměnu solí z membrány s chloridovými ionty Některé firmy používají chloridovou elektrodu v pevné fázi (AgCl) Coulometrie: Stanovení chloridů založeno na generaci Ag+ ze stříbrné anody konstantní rychlostí (konst. proud) Ionty stříbra reagují s chloridy chlorid stříbrný V bodě ekvivalence se generace stříbrných iontů zastaví Obsah chloridů přímo úměrný času Rutinně se nepoužívá
2Cl- + Hg(SCN)2 HgCl2 + 2 SCN- 3SCN- + Fe3+ Fe (SCN)3 červený thiokyanatan železitý se fotometruje v současnosti se nedoporučuje
Stanovení v plné krvi Provádí se na přístrojích na měření ABR pomocí ISE elektrod na Na, K a Cl v heparizovaných stříkačkách nebo kapilárách
Doporučená rutinní metoda: Doporučená rutinní metoda: FAAS, FAES, ISE direct, ISE indirect, fotometricky s o-kresolftalexonem, s arsenazo III Referenční metoda: ID-MS, FAAS, IC (navržená)
Referenční rozmezí: Referenční rozmezí: Vápník celkový S/P 2,15-2,55 mmol/l moč M 2,4-7,5 mmol/24 hod Ž 2,4-6,2 mmol/24 hod Vápník ionizovaný krev 1,12-1,32 mmol/l
Tři formy Tři formy ½ vázána na bílkoviny (80% na albumin, zbytek na globuliny) 6% - ve formě komplexních sloučenin ( citrát, laktát, hydrogenuhličitan, fosfát). necelá 1/2 vápník ionizovaný ( volný) Fyziologicky aktivní pouze ionizovaný vápník Jeho koncentraci reguloují hormony PTH a 1,25-dihydroxyvitamin D. Stanovení ionizovaného kalcia se masově neprovádí
Fotometrické metody: Fotometrické metody: Stanovení s o-kresolftaleinkomplexonem: Při pH 12 reagují vápenaté ionty s o-kresolftaleinkomplexonem Vznik stabilního purpurového komplexu s abs. max. 600 nm Magnesium maskováno s 8- hydroxychinolinem Metoda citlivá na vzdušný CO2 - komínky
Fotometrické metody: Fotometrické metody: Stanovení s arsenazo III: Imidazolový pufr, pH 6 vápenaté ionty + arzenazo III modrý komplex činidlo má specifickou afinitu k vápníku (pH 6) Stanovení s NM-BAPTA: Vápenaté ionty + 5-nitro-5’-metyl-BAPTA (pH10) komplex Ca-NM-BAPTA – ten reaguje s EDTA (pH7,3) komplex Ca-EDTA Úbytek absorbance při 600 nm je úměrný koncentraci vápníku
Stanovení pomocí AAS: Stanovení pomocí AAS: Naředění (1:50) roztokem chloridu lantanitého nebo strontnatého v kyselém prostředí Plamen acetylén-vzduch, Ca-lampa Naředění podpoří disociaci uvolnění z fosfátů, snížení viskozity Stanovení se běžně neprovádí
Pomocí ISE na speciálním přístroji nebo přístroji na ABR Pomocí ISE na speciálním přístroji nebo přístroji na ABR Měří se rozdíl potenciálu mezi Ca ISE, resp. pH elektrodou a referenční elektrodou Vydává se i výsledek přepočítaný na pH 7,4 ISE elektroda měří aktivitu – ta je přepočítávána na koncentraci pomocí aktivitního koeficientu Kalibrátory musí mít stejnou iontovou sílu (koncentrace sodných a chloridových iontů) Stanovení se provádí z plné krve odebrané do heparinizovaných stříkaček či kapilár
Fotometrické stanovení ze sbírané moče Specifičtější stanovení pomocí AAS Vzorek předem okyselit s HCl, rozpustit potenciální krystaly solí U pacientů se sklonem ke zvýšené tvorbě krystalů (pro stanovení souboru litiázy) okyselit celý objem sbírané moče AAS v některých laboratořích v moči rutinně
Doporučená rutinní metoda: FAAS, enzymová UV metoda, fotometrické metody Doporučená rutinní metoda: FAAS, enzymová UV metoda, fotometrické metody Referenční metoda: FAAS, IC (navržená) Stanovení v séru nebo v plasmě: V séru nebo plasmě se magnesium vyskytuje ve třech formách. 55% hořečnatých iontů je volných, asi 30% je vázáno na bílkoviny, zejména na albumin a 15% - se vyskytuje ve formě komplexních sloučenin ( citrát, fosfát atd.).
Referenční rozmezí: Referenční rozmezí: hořčík celkový S/P 0,65-1,05 mmol/l moč 3,0-5,0 mmol/24 hod hořčík ionizovaný krev 0,40-0,65 mmol/l
Fotometrické metody: Fotometrické metody: Stanovení s xylidylovou modří (magon): Mg2+ + xylidylová modř v alkalickém prostředí Vznik purpurové diazoniové soli, abs. max. 600 nm Ca2+ maskovány s EGTA (kyselina etylen glykol – bis(aminoetyl) tertraoctová) Stanovení s Arzenazo: Mg2+ reagují v alkalickém prostředí s chromogenem arzenazo Vznik fialového komplexu, abs. max. 570 nm Interferenci vápníku zabráněno specifickým komplexotvorným činidlem
Fotometrické metody: Fotometrické metody: Stanovení s Chlorphfosphonazo III Chlorophosphonazo III (CPZ III) reaguje s hořečnatými ionty za vzniku komplexu Mg-CPZ III. Interferenci Ca 2+ zabraňuje EGTA ( ethylen bis(oxyethylennitrilo)tetra-octová kyselina) - inhibuje vazbu vápníku na CPZ III pH 7,5
Stanovení s calmagitem: Stanovení s calmagitem: Fotometrické stanovení se provádí rovněž v alkalickém prostředí při 520 nm. Kalcium může být maskováno s EGTA. Stanovení s AAS: Stanovení ve provádí po naředění séra (1:50) roztokem chloridu lantanitého nebo strontnatého v kyselém prostředí. Tím se uvolní hořečnaté ionty z komplexů s fosfáty a proteiny. Dojde rovněž ke snížení viskozity. Ke stanovení se používá plamen acetylén-vzduch. V laboratořích klinické biochemie se běžně neprovádí.
Volné magnesium - B: Volné magnesium - B: Stanovení s ISE – spec. přístroj nebo přístroj na ABR (Nova Biomedical) Krátká životnost (1 měsíc), nízká frekvence stanovení, finanční náročnost Stanovení se provádí z plné krve odebrané do heparinizovaných stříkaček či kapilár Stanovení Mg v moči: Fotometrické stanovení ze sbírané moče Specifičtější stanovení pomocí AAS Vzorek předem okyselit s HCl, rozpustit potenciální krystaly solí U pacientů se sklonem ke zvýšené tvorbě krystalů (pro stanovení souboru litiázy) okyselit celý objem sbírané moče AAS v některých laboratořích v moči rutinně
Doporučená rutinní metoda: UV molybdátová metoda Doporučená rutinní metoda: UV molybdátová metoda Referenční metoda: neexistuje (navrhovaná ID-MS, IC) Stanovení v séru, plasmě a moči: Poměr H2PO4- : HPO42- je v kyselém prostředí 1:1, při pH 7,4 1:4 a v alkalické oblasti 1:9 10% fosfátů v séru vázáno na protein, 35% tvoří komplexy s natriem, kalciem a magnesiem, zbývajících 55% volných V krvi anorganické i organické fosfáty Stanovuje se fosfor anorganický, organické estery lokalizovány v buněčných elementech
Referenční rozmezí: Referenční rozmezí: S/P dospělí 0,9-1,5 mmol/l děti 1-2 roky 1,5-2,2 mmol/l moč 13,0-42,0 mmol/24 hod
Stanovení P s molybdenanem amonným: Stanovení P s molybdenanem amonným: Prostředí kyseliny sírové Vznik fosfomolybdátového komplexu (NH4)3[PO4(MoO3)12] a) detekce při 340 nm b) nebo následná reakce fosfomolybdátového komplexu s redukčním činidlem (kyselina aminonaftolsulfonová – nízká stabilita) fosfomolybdenová modř - 650 nm Stanovení P s molybdenanem a vanadičnanem amonným: Kyselé prostředí Vznik žluté kyseliny molybdátovanadátofosforečné Analýza po vysrážení bílkovin ze supernatantu Jinak nadhodnocení anorganického fosforu (při reakci dochází k hydrolýze organických esterů) Není vhodná k automatizaci
Doporučená rutinní metoda: fotometrie s ferrozinem Doporučená rutinní metoda: fotometrie s ferrozinem Stanovení v séru nebo plasmě: Fe3+ vázáno na transportní beta1-globulin apotransferin . Měřená koncentrace železa odpovídá Fe3+ vázanému v sérovém transferinu, nezahrnuje železo obsažené v séru jako volný hemoglobin Běžně Fe3+ obsazuje pouze jednu třetinu vazebných míst v transferinu Navázaná část - saturace transferinu
Referenční rozmezí: Referenční rozmezí: S/P M 10,6-28,3 umol/l Ž 6,6-26,0 umol/l
Po uvolnění z transferinu a po redukci na Fe2+ reakcí se skupinou –N= CH-HC=N Po uvolnění z transferinu a po redukci na Fe2+ reakcí se skupinou –N= CH-HC=N Tvorba barevných komplexů Fotometrické stanovení
Stanovení železa s ferrozinem: Stanovení železa s ferrozinem: Železo se uvolní z komplexu s transferinem přidáním citrátového pufru (pH<2) Fe3+ redukováno kyselinou askorbovou na dvojmocné Fe2+ s ferrozinem modrý komplex, abs. max. 570 nm Stanovení železa s bathofenantrolinem: V minulosti nejčastěji používána Není však vhodná pro automatizaci (deproteinace), pak se trojmocné železo s kyselinou thioglykolovou redukovalo na dvojmocné. S bathofenantrolinem pak dává Fe2+ červený komplex.
Interference: Interference: Při fotometrických stanoveních hemolýza zanedbatelný vliv Větší vliv hemolýza při stanovení pomocí AAS Stanovení v moči: AAS Provádí se zřídka Nízká koncentrace železa v moči – nevhodné fotometrické metody
Celková a volná vazebná kapacita železa: Celková a volná vazebná kapacita železa: Celková vazebná kapacita železa (TIBC) je metoda, která se využívá k výpočtu saturace transferinu: Koncentrace Fe v séru Saturace transferinu (%) = ---------------------------- x 100 Konc. TIBC V současnosti minimální použití Výpočet saturace transferinu – provádí se z koncentrace transferinu a železa Koncentrace Fe v séru (umol/l) Saturace transferinu (%) = -------------------------------- x 3,98 x100 Konc. Transferinu (g/l)
S/P celková vazebná kapacita 45-75 umol/l saturace transferinu železem M 0,21-0,40 Ž 0,20-0,36
V minulosti – nelze automatizovat V minulosti – nelze automatizovat Přídavek nadbytku roztoku chloridu želetitého - vysycení transferinu Přidat pevný uhličitan hořečnatý – reaguje s přebytečným Fe Směs se promíchá, po půl hodině odstředí V supernatantu se stanoví koncentrace Fe odpovídající celkové vazebné kapacitě železa
Alkal. pufr, přídavek známé konc. Fe2+ v nadbytku. Specifická vazba na transferin Nezreagované Fe2+ stanoveny s ferrozinem Rozdíl mezi koncentrací původně přidáváných Fe2+ a stanovenou koncentrací = volné vazebné kapacitě Celková vazebná kapacita - součet volné vazebné kapacity a sérového železa
v organismu ve velmi nízkých koncentracích (μmol/l) dostatečně citlivá metoda v preanalytické fázi zabránit kontaminaci biologického vzorku
ZINEK Analyzovaný materiál: S, P, U Stabilita: S 2 týdny (+4 °C), 1r (-20 °C ) Speciální preanalytické požadavky: zabránit kontaktu s gumou Referenční rozmezí: S,P 9,5 – 19,0 μmol/l dU 3,0 – 9,0 μmol/24h
MĚĎ Analyzovaný materiál: S, P, U Stabilita: S 2 týdny (+4 °C), 1r (-20 °C ) Speciální preanalytické požadavky: obecná pravidla pro stopovou analýzu Referenční rozmezí: S,P M 11,0-22,0 μmol/l Ž 12,5-24,0 μmol/l dU 0,2 – 0,9 μmol/24h
SELEN Analyzovaný materiál: S, P, B Stabilita: S 2 týdny (+4 °C), 1r (-20 °C ) Speciální preanalytické požadavky: obecná pravidla pro stopovou analýzu Referenční rozmezí: S,P 0,8 – 1,2 μmol/l dU 0,1 – 0,4 μmol/24h
Referenční metoda: Neutronová aktivační analýza (NAA) Referenční metoda: Neutronová aktivační analýza (NAA) nedestruktivní Doporučené metody: ATOMOVÁ ABSORPČNÍ SPEKTROMETRIE - PLAMENOVÁ (FAAS) - S ELEKTROTERMICKOU ATOMIZACÍ (ETA-AAS) ATOMOVÁ EMISNÍ SPEKTROMETRIE S INDUKČNĚ VÁZANÝM PLAZMATEM (ICP-AES) a její modifikace
ATOMOVÁ EMISNÍ SPEKTROMETRIE S INDUKČNĚ ATOMOVÁ EMISNÍ SPEKTROMETRIE S INDUKČNĚ VÁZANÝM PLAZMATEM výboj vzniká v proudu argonu – ten protéká plazmovou hlavicí v kruhové indukční cívce kde protéká vysokofrekvenční proud a vzniká elektromagnetické pole teplota 5000° - 10000° K dochází snadno k vypaření aerosolu vzorku, disociaci, atomizaci a excitaci atomů prvků čarovou emisí excitovaných atomů a iontů je tvořeno záření záření je monochromatizováno v mřížkovém spektrálním přístroji a detekováno multiprvková analýza
Dostları ilə paylaş: |