Natrium, kalium, chloridy – S,P,u stanovení na ise modulech

Natrium, kalium, chloridy – S,P,U

• Stanovení na ISE modulech

• Společné stanovení

• Tři ISE elektrody, jedna referenční (argentchloridová elektroda )

• Měří se rozdíl potenciálu mezi IS elektrodou a referenční elektrodou

• ISE elektroda měří aktivitu, přepočet na koncentraci pomocí aktivitního koeficientu

• Nepřímá a přímá potenciometrie

Metoda nepřímá - historicky starší

• Analýza vzorku značně naředěného (např. 30x) diluentem o vysoké iontové síle

• Generovaný elektrický potenciál porovnáván s potenciálem standardních roztoků – korekce na teplotu nebo elektrické nestability

• Koncentrace iontů se počítá podle Nerstovy rovnice

Metoda nepřímá

• Výsledky odpovídají měření plamenovou emisní spektrofotometrií

• Chyba způsobená přítomností proteinů a lipidů v plasmě (7%)

• Naměřené hodnoty se počítají na celkový objem plasmy

• Např. koncentrace 145 mmol Na+/l bude ve vodné fázi (počítáme-li 93% vodné fáze) ve skutečnosti 156 mmol Na+/l

• Negativní chyba známa po řadu let

• S miniaturizací elektrod - přímá metoda - neprosadila se

• Jednotlivé ISE elektrody

• Elektrody integrované - integrovaná chipová technologie

• Na basi tenkovrstvé ionoforové technologie (ionofory umožňují transport iontů přes membránu)

• Makrocyklické ionofory - molekuly s dutinou, ve které jsou pevně vázané ionty - crown étery

Sodík ( Natrium)

• Doporučená rutinní metoda: FAES (s Li spektrálním pufrem), ISE direct, ISE indirect

• Referenční metoda: ID-MS, FAES,

• IC (navržená)

• Hlavní extracelulární kationt – reprezentuje 90 % všech kationtů v plasmě

• Hraje centrální roli v  distribuci vody

• Výrazně se podílí na osmotickém tlaku v extracelulární tekutině

• Stanovení Na pomocí ISE:

• skleněná sodíková elektroda

• nebo crown éterový případně crown malonátový ionofor integrovaný do iontověselektivní plastové membrány (PVC, teflon)

• Enzymatické stanovení Na (nedoporučuje se):

• Metoda založena na aktivaci enzymu b-galoktosidasy ionty sodíku

• Hydrolýza chromogenního substrátu 2 – nitrofenyl - b - D - galaktopyranosidu na galaktosu a 2-nitrofenol

• Rychlost hydrolýzy se měří kineticky při 420 nm

• Stanovení Na plamenovou emisní

• spektrofotometrií:

• Excitované atomy Na emitují spektra s ostrou čarou při 768 nm

• Rutinně se již nepoužívá

Draslík (Kalium)

• Doporučená rutinní metoda: FAES (s Li spektrálním pufrem), ISE direct, ISE indirect

• Referenční metoda: ID-MS, FAES,

• IC (navržená)

• Hlavní intracelulární kationt - koncentrace v erytrocytech je 23x vyšší než v plasmě

• Vysoká koncentrace uvnitř buněk zajištěna pomalou difuzí přes buněčnou membránu ven

• Na+,K+ - ATPasová pumpa transportuje kalium do buněk proti koncentračnímu gradientu

• Interference: Hemolýza zvyšuje hodnoty draslíku

• Stanovení K pomocí ISE:

• PVC membrána, v ní zabudován valinomycin (na principu iontové výměny)

• Stanovení K plamenovou emisní spektrofotometrií:

• Excitované atomy K emitují spektra s ostrou čarou při 589 nm

• Rutinně se nepoužívá

• Enzymatické stanovení K:

• Metoda založena na aktivaci vhodného enzymu ionty draslíku

• Např. tryptofanasa se substrátem tryptofanem

• Metoda není doporučena

Chloridy

• Doporučená rutinní metoda: Coulometrie, ISE direct, ISE indirect

• Referenční metoda: Coulometrie

• Hlavní extracelulární aniont - největší frakce anorganických aniontů v plasmě

• Zásadní role v normální distribuci vody

• Výrazný podíl na osmotickém tlaku v extracelulární tekutině

• Stanovení Cl pomocí ISE:

• Polymerní membrána – v ní kvarterní amoniové soli

• Např. trioktylpropylamonium chlorid dekanol

• Membrána zajišťuje iontovou výměnu solí z membrány s chloridovými ionty

• Některé firmy používají chloridovou elektrodu v pevné fázi (AgCl)

• Coulometrie:

• Stanovení chloridů založeno na generaci Ag+ ze stříbrné anody konstantní rychlostí (konst. proud)

• Ionty stříbra reagují s chloridy  chlorid stříbrný

• V bodě ekvivalence se generace stříbrných iontů zastaví

• Obsah chloridů přímo úměrný času

• Rutinně se nepoužívá

• Spektrofotometrické stanovení Cl:

• 2Cl- + Hg(SCN)2 HgCl2 + 2 SCN-

• 3SCN- + Fe3+  Fe (SCN)3

• červený thiokyanatan železitý se fotometruje

• v současnosti se nedoporučuje

Natrium, kalium, chloridy- B

• Stanovení v plné krvi

• Provádí se na přístrojích na měření ABR pomocí ISE elektrod na Na, K a Cl v heparizovaných stříkačkách nebo kapilárách

Vápník (Kalcium)

• Doporučená rutinní metoda:

• FAAS, FAES, ISE direct, ISE indirect, fotometricky s o-kresolftalexonem, s arsenazo III

• Referenční metoda: ID-MS, FAAS,

• IC (navržená)

Stanovení vápníku v S,P,B :

• Tři formy

• ½ vázána na bílkoviny (80% na albumin, zbytek na globuliny)

• 6% - ve formě komplexních sloučenin ( citrát, laktát, hydrogenuhličitan, fosfát).

• necelá 1/2 vápník ionizovaný ( volný)

• Fyziologicky aktivní pouze ionizovaný vápník

• Jeho koncentraci regulují hormony PTH a 1,25-dihydroxyvitamin D

• Stanovení ionizovaného kalcia se masově neprovádí

a)Celkový vápník – S,P:

• Fotometrické metody:

• Stanovení s o-kresolftaleinkomplexonem:

• Při pH 12 reagují vápenaté ionty s o-kresolftaleinkomplexonem

• Vznik stabilního purpurového komplexu s abs. max. 600 nm

• Magnesium maskováno s 8- hydroxychinolinem

• Metoda citlivá na vzdušný CO2 - komínky

a) Celkový vápník – S.P:

• Fotometrické metody:

• Stanovení s arsenazo III:

• Imidazolový pufr, pH 6

• vápenaté ionty + arzenazo III  modrý komplex

• činidlo má specifickou afinitu k vápníku (pH 6)

• Stanovení pomocí AAS:

• Naředění (1:50) roztokem chloridu lantanitého nebo strontnatého v kyselém prostředí

• Plamen acetylén-vzduch, Ca-lampa

• Naředění podpoří disociaci  uvolnění z fosfátů, snížení viskozity

• Stanovení se běžně neprovádí

b) Volné (Ionizované) kalcium - B

• Pomocí ISE na speciálním přístroji nebo přístroji na ABR

• Měří se rozdíl potenciálu mezi Ca ISE, resp. pH elektrodou a referenční elektrodou

• Vydává se i výsledek přepočítaný na pH 7,4

• ISE elektroda měří aktivitu – ta je přepočítávána na koncentraci pomocí aktivitního koeficientu

• Kalibrátory musí mít stejnou iontovou sílu (koncentrace sodných a chloridových iontů)

• Stanovení se provádí z plné krve odebrané do heparinizovaných stříkaček či kapilár

Stanovení vápníku v moči

• Fotometrické stanovení ze sbírané moče

• Specifičtější stanovení pomocí AAS

• Vzorek předem okyselit s HCl, rozpustit potenciální krystaly solí

• U pacientů se sklonem ke zvýšené tvorbě krystalů (pro stanovení souboru litiázy) okyselit celý objem sbírané moče

• AAS v některých laboratořích v moči rutinně

Hořčík ( Magnesium):

• Doporučená rutinní metoda: FAAS, enzymová UV metoda, fotometrické metody

• Referenční metoda: FAAS, IC (navržená)

• Stanovení v séru nebo v plasmě:

• V séru nebo plasmě se magnesium vyskytuje ve třech formách. 55% hořečnatých iontů je volných, asi 30% je vázáno na bílkoviny, zejména na albumin a 15% se vyskytuje ve formě komplexních sloučenin ( citrát, fosfát atd.)

a) Celkové magnesium:

• Fotometrické metody:

• Stanovení s xylidylovou modří (magon):

• Mg2+ + xylidylová modř v alkalickém prostředí

• Vznik purpurové diazoniové soli,  abs. max. 600 nm

• Ca2+ maskovány s EGTA (kyselina etylen glykol – bis(aminoetyl) tertraoctová)

• Stanovení s Arzenazo:

• Mg2+ reagují v alkalickém prostředí s chromogenem arzenazo

• Vznik fialového komplexu,  abs. max. 570 nm

• Interferenci vápníku zabráněno specifickým komplexotvorným činidlem

a) Celkové magnesium – pokr.:

• Stanovení s calmagitem:

• Fotometrické stanovení se provádí rovněž v alkalickém prostředí při 520 nm. Kalcium může být maskováno s EGTA.

• Stanovení s AAS:

• Stanovení ve provádí po naředění séra (1:50) roztokem chloridu lantanitého nebo strontnatého v kyselém prostředí. Tím se uvolní hořečnaté ionty z komplexů s fosfáty a proteiny. Dojde rovněž ke snížení viskozity. Ke stanovení se používá plamen acetylén-vzduch. V laboratořích klinické biochemie se běžně neprovádí.

• Volné magnesium - B:

• Stanovení s ISE – spec. přístroj nebo přístroj na ABR

• (Nova Biomedical)

• Krátká životnost (1 měsíc), nízká frekvence stanovení, finanční náročnost

• Stanovení se provádí z plné krve odebrané do heparinizovaných stříkaček či kapilár

• Stanovení Mg v moči:

• Fotometrické stanovení ze sbírané moče

• Specifičtější stanovení pomocí AAS

• Vzorek předem okyselit s HCl, rozpustit potenciální krystaly solí

• U pacientů se sklonem ke zvýšené tvorbě krystalů (pro stanovení souboru litiázy) okyselit celý objem sbírané moče

• AAS v některých laboratořích v moči rutinně

Fosfor anorganický

• Doporučená rutinní metoda: UV molybdátová metoda

• Referenční metoda: neexistuje (navrhovaná ID-MS, IC)

• Stanovení v séru, plasmě a moči:

• Poměr H2PO4- : HPO42- je v kyselém prostředí 1:1, při pH 7,4 1:4 a v alkalické oblasti 1:9

• 10% fosfátů v séru vázáno na protein, 35% tvoří komplexy s natriem, kalciem a magnesiem, zbývajících 55% volných

• V krvi anorganické i organické fosfáty

• Stanovuje se fosfor anorganický, organické estery lokalizovány v buněčných elementech

• Stanovení P s molybdenanem amonným:

• Prostředí kyseliny sírové

• Vznik fosfomolybdátového komplexu (NH4)3[PO4(MoO3)12]

• a) detekce při 340 nm

• b) nebo následná reakce fosfomolybdátového komplexu s redukčním činidlem (kyselina aminonaftolsulfonová – nízká stabilita)  fosfomolybdenová modř - 650 nm

• Stanovení P s molybdenanem a vanadičnanem amonným:

• Kyselé prostředí

• Vznik žluté kyseliny molybdátovanadátofosforečné

• Analýza po vysrážení bílkovin ze supernatantu

• Jinak  nadhodnocení anorganického fosforu (při reakci dochází k hydrolýze organických esterů)

• Není vhodná k automatizaci

Železo

• Doporučená rutinní metoda: fotometrie s ferrozinem

• Referenční metoda: neexistuje

• Stanovení v séru nebo plasmě:

• Fe3+ vázáno na transportní beta1-globulin apotransferin

• Měřená koncentrace železa odpovídá Fe3+ vázanému v sérovém transferinu, nezahrnuje železo obsažené v séru jako volný hemoglobin

• Běžně Fe3+ obsazuje pouze jednu třetinu vazebných míst v transferinu

• Navázaná část - saturace transferinu

Princip stanovení Fe:

• Po uvolnění z transferinu a po redukci na Fe2+ reakcí se skupinou –N= CH-HC=N

• Tvorba barevných komplexů

• Fotometrické stanovení

•  

• Stanovení železa s ferrozinem:

• Železo se uvolní z komplexu s transferinem přidáním citrátového pufru (pH<2)

• Fe3+ redukováno kyselinou askorbovou na dvojmocné

• Fe2+ s ferrozinem modrý komplex, abs. max. 570 nm

• Stanovení železa s bathofenantrolinem:

• V minulosti nejčastěji používána

• Není však vhodná pro automatizaci (deproteinace),

• pak se trojmocné železo s kyselinou thioglykolovou redukovalo na dvojmocné

• S bathofenantrolinem pak dává Fe2+ červený komplex

• Interference:

• Při fotometrických stanoveních hemolýza zanedbatelný vliv

• Větší vliv hemolýza při stanovení pomocí AAS

• Stanovení v moči:

• AAS

• Provádí se zřídka

• Nízká koncentrace železa v moči – nevhodné fotometrické metody

• Celková a volná vazebná kapacita železa:

• Celková vazebná kapacita železa (TIBC) je metoda, která se využívá k výpočtu saturace transferinu:

• Koncentrace Fe v séru

• Saturace transferinu (%) = ---------------------------- x 100

• Konc. TIBC

• V současnosti minimální použití

• Výpočet saturace transferinu – provádí se z koncentrace

• transferinu a železa

• Koncentrace Fe v séru (umol/l)

• Saturace transferinu (%) = -------------------------------- x3,98

• Konc. Transferinu (g/l)

Stanovení celkové vazebné kapacity železa:

• V minulosti – nelze automatizovat

• Přídavek nadbytku roztoku chloridu železitého - vysycení transferinu

• Přidat pevný uhličitan hořečnatý – reaguje s přebytečným Fe

• Směs se promíchá, po půl hodině odstředí

• V supernatantu se stanoví koncentrace Fe odpovídající celkové vazebné kapacitě železa

Stanovení volné vazebné kapacity železa:

• Alkal. pufr, přídavek známé konc. Fe2+ v nadbytku

• Specifická vazba na transferin

• Nezreagované Fe2+ stanoveny s ferritinem

• Rozdíl mezi koncentrací původně přidáváných Fe2+ a stanovenou koncentrací = volné vazebné kapacitě

• Celková vazebná kapacita - součet volné vazebné kapacity a sérového železa