Definicija

DEFINICIJA

• Biosenzor se može definisati kao uređaj koji ima ugrađenu biološki aktivnu komponentu u bliskom kontaktu sa fizičko-hemijskim pretvaračem i procesorom elektronskog signala

Shema biosenzora

Pretvarača (transducer) - pretvara uočenu promenu (fizičku ili hemijsku) u mereni signal

• Pretvarača (transducer) - pretvara uočenu promenu (fizičku ili hemijsku) u mereni signal

• Prepoznavajućeg agensa – koji omogućava merenje samo one vrste koja nam je od interesa a koja se nalazi u smeši sa drugim vrstama

BIOKOMPONENETE

• Enzimi

• Antitela

• Membrane

• Organele

• Ćelije

• Tkiva

• Receptori

PRETVARAČI

• Elektrohemijski

• Optički

• Piezo-električni

• Kalorimetrijski

• Akustični

Enzimi

• Biološki elementi koji se najčešće koriste

• Mogu biti korišćeni u čistom obliku ili prisutni u mikroorganizmima ili biljnom materijalu bez prethodnog izolovanja

• Aktivnost mnogih enzima uključuje oksidaciju i redukciju koje mogu biti detektovane elektrohemijski

• Postoji pet glavnih klasa enzima.

• Oksidoreduktaze

• Transferaza

• Hidrolaze

• Liaze

• Izomeraze

Oksidoreduktaze

• Dehidrogenaze

• Oksidaze

• Peroksidaze

• Oksigenaze

Prednosti enzima:

• lako se vežu za odgovarajući supstrat

• visoko su selektivni

• imaju katalitičku aktivnost

• brzo se aktiviraju

• Enzimi su najčešće korišćene biološke komponente

Mane enzima:

• skupi su

• često gube aktivnost dok se imobilizuju na pretvaraču

• gube aktivnost posle relativno kratkog vremenskog perioda

Antitela

• Vezuju se specifično za odgovarajući antigen

• Prednosti:

• veoma su selektivni

• ultra osetljivi

• veoma se snažno vezuju

• Jedina mana im je što nemaju katalitički efekat

Nukleinske kiseline

• slične antitelima

• koriste se za detekciju genetskih bolesti, kancera i virusnih infekcija

• DNK istraživanja često uključuju dodatak označene DNK u sistem dodatkom nekog radioaktivnog elementa ili elektrofore

Metode imobilizacije

• Povezivanje selektivnih elemenata

• adsorpcijom selektivnog elementa na površinu

• kovalentnim vezivanjem

• mikrokapsulacijom

• cross-linking – koristi se bifunkcionalni agens da hemijski poveže pretvarač i selektivnu komponentu

• ‘zarobljavanjem’ - selektivni element se nalazi uhvaćen unutar gela, paste, ili polimera

TIPOVI BIOSENZORA

• Enzim/metabolički biosenzori

• Enzimske elektrode i ćelijske elektrode

• Bioafinitetni senzori

• Antitela
• Nukleinske kiseline
• Lektin

Enzim/metabolički senzori

• Supstrat + Enzim

Bioafinitetni senzori

• Ovi senzori se baziraju na interakcijama povezivanja između imobilizovanih biomolekula i analita od interesa.

• Ove interakcije su visoko selektivne.

• Pimeri obuhvataju antitelo-antigen interakcije, nukleinske kiseline za komplementarne sekvence i lektin za šećer

Bioafinitetni senzori

Pretvarači

• Potenciometrijski
• Amperometrijski
• Konduktometrijski

POTENCIOMETRIJSKI BIOSENZORI

• Kod potenciometrijskih senzora izmereni potencijal na selektivnoj memembrani ili elektrodnoj površini, koja je u kontaktu sa rastvorom, povezan je sa koncentracijom analita

• Potencijal se meri pri nultoj struji i prema referentnoj elektrodi (relativni)

• pH elektroda je osnovni potencionetrijski pretvarač u biosenzorima.

POTENCIOMETRIJSKI BIOSENZORI

• E = Eo + RT/nF ln[analit]

• Eo konstanta za sistem
• R univerzalna gasna konstanta
• T apsulutna temperatura
• n broj izmenjenih elektrona
• F Faradejeva konstanta
• ln[analit] prirodni logaritam od aktiviteta analita.

Najpoznatiji potenciometrijski senzor je jon-selektivna elektroda (ISE)

• Najpoznatiji potenciometrijski senzor je jon-selektivna elektroda (ISE)

• Tečne polimerne membranske elektorde su komercijalno raspoložive i rutinski se koriste selektivnu detekciju nekoliko jona (K+, Na+, Ca2+, NH4+, H+, CO32-) u složenim biološkim osnovama

• Antibiotici nonactin i valinomicin služe kao neutralni nosači za određivanje NH4+ i K+

Glukoza

• Glukoza

• glukoza + O2 → glukonska kiselina + H2O2 enzim:GOD

• dolazi do promene pH zbog nastanka glukonske kiseline

• merenjem promene potencijala (pH) možemo odrediti koncentraciju glukonske kiseline (a samim tim i glukoze)

ISE koje se koriste u kombinaciji sa imobilizovanim enzimoma mogu da služe kao osnova elektroda koje su selektivne za specifične enzimske supstrate

• ISE koje se koriste u kombinaciji sa imobilizovanim enzimoma mogu da služe kao osnova elektroda koje su selektivne za specifične enzimske supstrate

• Od njih su dva glavna: za ureu i za kreatinin.

• Ove potenciometrijske enzimske elektrode se prave ubacivanjem enzima ureaze i kreatinaze na površinu katjon osetljive (NH4+) ISE

Urea

• Urea

• CO(NH2)2 + 2 H2O → (NH4)2CO3

• koncentraciju uree možemo određivati primenom katjonske amonijum selektivne elektrode

• ili možemo napraviti alkalni rastvor i određivati slobodni amonijak koristeći amonijum selektivnu gasnu elektrodu

• Osetljivost odnosno granica detekcije iznosi (10-6 M )

Oksalati

• Oksalati

• C2O42- → 2 CO2 + H2O oksalat oksidaza

• Određivanje oksalata u urinu je značajno prilikom dijagnostike hiperokslurije

• Potenciometrijski pretvarač kod biosenzora koji se koristi za određivanje koncentracije CO2 (odnosno oksalata u mokraći) je CO2 gasna elektroda

Glukoza

• Glukoza

• Koristimo jodid selektivnu elektrodu

• glukoza + O2 → glukonska kiselina + H2O2

• enzim:GOD

• H2O2 + 2 I- + 2 H+ → I2 + 2 H2O enzim:PO

• Jodid-selektivna elektroda prati smanjenje koncentracije jodida što je prouzrokovano dejstvom vodonik-peroksida

AMPEROMETRIJSKI BIOSENZORI

• Kod amperometrijskih biosenzora elektrodni potencijal se drži na konstantnoj vrednosti dovoljnoj za oksidaciju ili redukciju vrste od interesa (ili supstance elektrohemijski vezane za nju)

• Jačina struje koja protiče je proporcijonalna koncentraciji analita

• Id = nFADsC/d

Amperometrijske enzimske elektrode koje se baziraju na oksidazama u kombinaciji sa vodonik proksid indikatorskim elektrodama postale su najuobičajeniji biosenzori

• Amperometrijske enzimske elektrode koje se baziraju na oksidazama u kombinaciji sa vodonik proksid indikatorskim elektrodama postale su najuobičajeniji biosenzori

• Kod ovih reakcija prati se, potrošnja kiseonika ili proizvodnja vodonik peroksida

• Prvi razvijeni biosenzor bazirao se na korišćenju kiseonične elektrode

• Enzim glukooksidaza (GOD) imobilisan je u poliakrilamidnom gelu na gas-propusnoj membrani koja pokriva elektrodu

Kroz razvoj biosensora se susrećemo hronološki sa tri generacije na osnovu mehanizma dejstva:

• prva generacija – senzori bazirani na kiseoničnim elektrodama

• druga generacija – senzori bazirani na medijatorima i

• treća generacija – elektrode sa ugrađenim enzimima

Mana kiseoničnih senzora je što su veoma skloni smetnjama od strane spoljašnjeg kiseonika

• Mana kiseoničnih senzora je što su veoma skloni smetnjama od strane spoljašnjeg kiseonika

• Zbog toga pratimo koncentraciju proizvedenog vodonik peroksida, a ne kiseonika koji se troši u reakciji

• H2O2 → 2H+ + 2e- + O2

• Na primenjenom potencijalu anodne oksidacije vodonik peroksida različita organska jedinjenja se oksiduju (vitamin C, mokraćna kiselina, glutation itd.)

Preduzeti su različiti pristupi za povećanje selektivnosti detektujuće elektrode, njenim hemijskim modifikacijama, korišćenjem:

• membrana

• medijatora

• metalizovanjem elektroda

• polimera

1.Membrane. Razvijene su različite permiselektivne membrane, koje kontrolišu vrste koje stižu do elektrode, na bazi naelektrisanja i veličine Primeri obuhvataju celuloza acetat (naelektrisanje i veličina), nafion (naelektrisanje) i polikarbonat (veličina). Nedostatak korišćenja membrana je njihov uticaj na difuziju.

2. Medijatori druga generacija biosenzora Mnogi oksidaza enzimi mogu da koriste veštačke elektron akceptorske molekule, koji se nazivaju medijatori Medijator je niskomolekulski redoks par koji može da prenese elektrone sa aktivnog mesta enzima na površinu elektrode, i na taj način uspostavlja električni kontakt izmađu njih Ovi medijatori imaju širok opseg struktura, a samim tim i osobina, uključujući i opsege redoks potencijala

Kao medijatori se koriste katjoni prelaznih metala i njihovi kompleksi

• Kao medijatori se koriste katjoni prelaznih metala i njihovi kompleksi

• Jedan od boljih medijatora je ferocen(Fc) – sendvič kompleks gvožđa i dva ciklopentadienil(Cp) anjona

• Princip dejstva medijatora na bazi ferocena

• glukoza + GODOx → glukonolakton + GODR + 2H+

• GODR + 2Fc+ → GODOx + 2Fc

• 2Fc – 2e- → 2Fc+

Dobri medijatori bi trebalo da:

• Dobri medijatori bi trebalo da:

• brzo reaguju sa enzimima

• reverzibilno izvode transfer elektrona

• imaju mali nadpotencijal pri regeneraciji

• nezavisni su od pH vrednosti

• stabilni su i u oksidovanom i u redukovanom obliku

• ne reaguju s kiseonikom

• nisu otrovni

• Ferocen zadovoljava sve uslove

Primeri medijatora koji se obično koriste:

• Primeri medijatora koji se obično koriste:

• Ferocen (nerastvoran)
• Ferocen dikarbonska kiselina (rastvoren)
• Dihloro-indofenol (DCIP)
• Tetrametil-fenilenediamin (TMPD)
• Fericijanid
• Rutenium hlorid
• Metilen Plavo (MB)

Primeri uobičajeno upotrebljavanih polimera:

• Primeri uobičajeno upotrebljavanih polimera:
• polipirol
• politiofen
• polianilin
• diaminobenzen
• polifenol

Treća generacija – elektrode sa ugrađenim enzimima

• Neophodan je da medijator bude ugrađen zajedno sa enzimom u elektrodu

• Nema redukcije ili oksidacije enzima direktno na elektrodi da bi se sprečila denaturacija na površini elektrode i gubitak enzimsku aktivnost