Defining kir and hla class I genotypes at Highest Resolution via High-Throughput Sequencing

low-frequency errors in sensitivity or specificity of the real-

time PCR method. We conclude that analysis of high-

throughput sequencing data with the PING_gc module

provides precise measurement of KIR gene content and

copy number and gives almost 100% accuracy. Using

PING_gc, we identified 26 distinct KIR gene copy-number

A

B

CN type 3DL3 2DS2 2DL2 2DL3 2DL5 2DS3 2DS5 2DP1 2DL1 3DP1 2DL4 3DL1 3DS1 2DS1 2DS4 3DL2

N

1

35

2

13

3

12

4

5

5

4

6

4

7

3

8

2

9

2

10

1

11

1

12

1

13

1

14

1

15

1

16

1

17

1

18

1

19

1

20

1

21

1

22

1

23

1

24

1

25

1

26

1

0

1

2

3

4

Copies of gene

cells tests concordance

real-time PCR error (N)

unexplained

(%)

allele

pos

neg

(N)

85

1700

99.41

4

2

2

2

C

GC type

3DL3

2DS2

2DL2/3

2DL5

2DS3

2DS5

2DP1

2DL1

3DP1

2DL4

3DL1/S1

2DS1

2DS4

3DL2

N

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

36

2

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

13

3

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

12

4

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

11

5

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

8

6

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

7

7

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

3

8

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

2

9

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

10

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

11

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

12

1

1

1

1

1

1

1

1

1

13

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

Figure 4.

KIR Gene-Content and Copy-Number Genotypes

(A) Gene-content genotypes derived from all 97 cell lines by the PING pipeline. A black box indicates that a gene is present, and a clear

box indicates the absence of a gene. One example from each observed gene-content genotype (GC type) is shown, and the number

observed is shown on the right.

(B) Independent validation of the KIR copy-number genotypes by real-time PCR

12

on 85 samples. There were four discrepancies due to

alleles undetected by real-time PCR (allele). There were two false positives (pos) and two false negatives (neg) by real-time PCR. Two dis-

crepancies remain unexplained.

(C) Gene copy-number genotypes derived from all 97 cell lines by PING_gc. A colored rectangle indicates the presence of a gene, and the

shades represent the copy number as indicated in the key. One example from each observed gene copy-number genotype (CN type) is

shown, and the number observed is shown on the right.

382

The American Journal of Human Genetics 99, 375–391, August 4, 2016

---

genotypes in the 97 cell lines analyzed (

Figure 4

C). Two

cells have duplicated KIR3DP1-KIR2DL4-KIR3DL1/S1 seg-

ments (copy-number genotypes 10 and 18;

Figure 4

C),

and three cells have haplotypes lacking KIR2DL4 (geno-

types 12, 13, and 15;

Figure 4

C). In summary, determina-

tion of copy number alone increases the resolution of

KIR genotyping and is an important step toward under-

standing the role of KIR polymorphism in disease.

61

We

next sought to include the allele-calling components in

validation of the PING pipeline in order to achieve full res-

olution of KIR genotypes.

High-Resolution Genotypes of KIR Alleles: PING_allele

PING_allele determines KIR allele genotypes according

to all known KIR coding-sequence alleles (

Material and

Methods

). PING_allele was first validated with whole-

exome data from a sample of 15 KhoeSan individuals.

47

For these individuals, the KIR copy-number and allele

data produced by PING matched the data obtained previ-

ously by the established methods of Sanger sequencing

and pyrosequencing-based genotyping of KIR genes.

16,31

Because KIR3DL1, KIR3DS1, and KIR3DL2 of lineage II

KIR (see

Appendix A

) exhibit high polymorphism and

structural variation,

13,23,62

they were chosen as a further

test of PING_allele. Using the capture/NGS method, we

applied the pipeline to data obtained from 30 family trios

from Mali in West Africa (sample set 2,

Material and

Methods

). In this highly heterozygous population, we

identified 18 KIR3DL1/S1, 15 KIR3DL2, and 3 KIR3DL1/2v

alleles (

Table S1

A). These alleles were authenticated by es-

tablished pyrosequencing and Sanger sequencing methods

(

Material and Methods

), as well as by their segregation in

the trios. KIR3DL1/2v is a KIR3DL1-KIR3DL2 fusion gene

that segregates with KIR3DL1/S1 and encodes a func-

tional protein.

13

Importantly, we correctly identified indi-

viduals with distinct combinations of KIR3DL1/S1 alleles,

KIR3DL1/2v fusion genes, and KIR3DL1/S1-deleted haplo-

types (

Figure 5

). To expand the analysis, we next analyzed

2,112 individuals from the 1000 Genomes dataset.

48

From

their exome sequences, we identified 50 KIR3DL1/S1, 46

KIR3DL2, and 5 KIR3DL1/2v alleles (

Table S1

A), as well as

14 KIR3DL1/S1 duplication and 13 KIR3DL1/S1 deletion

haplotypes (

Table S1

B). Such duplicated and deleted KIR

haplotypes were detected in all 26 populations represented

in the 1000 Genomes dataset (

Table S1

B). These results

demonstrate that the capture/NGS method coupled with

the copy-number and allele components of the PING pipe-

line can correctly identify the extensive and complex vari-

ation of lineage II KIR molecules. The KIR3DL1/S1 and

KIR3DL2 genotypes obtained for all individuals analyzed

from the 1000 Genomes Project are shown in

Table S1

C.

Identification of Novel Alleles by PING

Hereafter, we use ‘‘novel’’ to describe KIR variants that were

previously undiscovered but identified and characterized

by the methods described here. The PING pipeline iden-

tifies such novel alleles by the presence of either one or

more novel SNPs or a novel combination of known SNPs

(

Material and Methods

). To test this ‘‘new allele discovery’’

component of PING, we again used the lineage II KIR

genes. In the course of analyzing the 1000 Genomes

data, we identified 100 novel alleles: 33 KIR3DL1/S1, 65

KIR3DL2, and 2 KIR3DL1/2v alleles. Defining these alleles

are 88 novel SNPs (39 in KIR3DL1/S1 and 49 in KIR3DL2;

Tables

S2

A and

S2

B) and 17 novel combinations of known

SNPs (

Table S2

C). Sequences of all the novel alleles were

validated by standard methods: PCR amplification from

genomic DNA of source material and subsequent cloning

and/or Sanger sequencing (

Material and Methods

). Of

the 2,112 individuals studied, 229 (10.8%) have at least

one novel lineage II KIR allele (

Table S1

C). A total of 333

different KIR3DL1/S1-KIR3DL2 haplotypes were identified

in this analysis (

Table S1

C).

High-Resolution KIR Allele and Copy-Number Genotypes

We applied PING_allele to the KIR sequence data obtained

from the 97 IHWG cells. This analysis of 13 KIR genes iden-

tified 144 different KIR sequences: 128 corresponding to

established alleles and 16 representing novel alleles. The

latter were all shown to be authentic by the standard

methods described above for KIR3DL1/S1 and KIR3DL2

(

Table S2

D). By considering all 144 KIR variants, we identi-

fied a minimum of 104 centromeric and 42 telomeric KIR

C

F

M

C

F

M

C

F

M

C

F

M

1

4

3

2

*03101

*00401

*001

*00301

*03101

*068

*001

*008

*00401

*024N

*00301

*001

*007

*059

*008

*007

*01501

*008

*013

*059

*01501

*013

*00401

*00301

*006

*00401

*01502

*00301

*001

*01701

*006

*010

*059

*006

*068

*006

*008

*059

*068

*008

Family

KIR3DL1/S1

KIR3DL2

Figure 5.

High-Resolution Allele-Level Genotyping of KIR Genes

Four examples of high-resolution allele and copy-number geno-

types of lineage II KIR genes and their segregation in family trios:

C, child; F, father; and M, mother. Colored boxes show the segre-

gating alleles. All members of family 1 have two alleles each of

KIR3DL1/S1 and KIR3DL2. Family 2 shows segregation of the

KIR3DL1/2v fusion gene (the allele named KIR3DL1*059), which

consists of exons 1–6 from KIR3DL1 and 7–9 from KIR3DL2.

13,63

For clarity, KIR3DL1/2v is shown as an allele of KIR3DL1, so there

is no allele of KIR3DL2 on this haplotype. Family 3 shows segrega-

tion of a haplotype that lacks KIR3DL1/S1 and is marked by the

presence of KIR3DL2*006. The gene copy numbers were deter-

mined by PING_gc, which indicated that one copy of KIR3DL1

is present in each of individuals 3C and 3M and two copies are

present in 3F. Family 4 shows segregation of both the KIR3DL1/

2v and the KIR3DL1 negative haplotypes to the child.

The American Journal of Human Genetics 99, 375–391, August 4, 2016

383

---