Defining kir and hla class I genotypes at Highest Resolution via High-Throughput Sequencing

---

ARTICLE

Defining KIR and HLA Class I Genotypes

at Highest Resolution via High-Throughput Sequencing

Paul J. Norman,

1

,

*

Jill A. Hollenbach,

2

Neda Nemat-Gorgani,

1

Wesley M. Marin,

2

Steven J. Norberg,

3

Elham Ashouri,

1

Jyothi Jayaraman,

4

Emily E. Wroblewski,

1

John Trowsdale,

4

Raja Rajalingam,

5

Jorge R. Oksenberg,

2

Jacques Chiaroni,

6

Lisbeth A. Guethlein,

1

James A. Traherne,

4

Mostafa Ronaghi,

3

and Peter Parham

1

The physiological functions of natural killer (NK) cells in human immunity and reproduction depend upon diverse interactions between

killer cell immunoglobulin-like receptors (KIRs) and their HLA class I ligands: HLA-A, HLA-B, and HLA-C. The genomic regions contain-

ing the KIR and HLA class I genes are unlinked, structurally complex, and highly polymorphic. They are also strongly associated with a

wide spectrum of diseases, including infections, autoimmune disorders, cancers, and pregnancy disorders, as well as the efficacy of trans-

plantation and other immunotherapies. To facilitate study of these extraordinary genes, we developed a method that captures, se-

quences, and analyzes the 13 KIR genes and HLA-A, HLA-B, and HLA-C from genomic DNA. We also devised a bioinformatics pipeline

that attributes sequencing reads to specific KIR genes, determines copy number by read depth, and calls high-resolution genotypes for

each KIR gene. We validated this method by using DNA from well-characterized cell lines, comparing it to established methods of HLA

and KIR genotyping, and determining KIR genotypes from 1000 Genomes sequence data. This identified 116 previously uncharacterized

KIR alleles, which were all demonstrated to be authentic by sequencing from source DNA via standard methods. Analysis of just two KIR

genes showed that 22% of the 1000 Genomes individuals have a previously uncharacterized allele or a structural variant. The method we

describe is suited to the large-scale analyses that are needed for characterizing human populations and defining the precise HLA and KIR

factors associated with disease. The methods are applicable to other highly polymorphic genes.

Introduction

The human leukocyte antigen (HLA) complex of chromo-

some 6 is the most polymorphic region of the human

genome.

1

This variation is driven by pressure to resist

diverse pathogens but also underlies susceptibility to auto-

immunity and other inflammatory diseases of major

importance to human health.

2

HLA class I molecules are

expressed on the surface of most tissue cells, where they

interact with receptors on the surface of lymphocytes,

effector cells of the immune system.

3

Natural killer (NK)

cells are innate and adaptive lymphocytes that destroy in-

fected or tumor cells with aberrant expression of HLA class

I; they also regulate trophoblast invasion during early preg-

nancy.

4

NK cell activity is genetically modulated through

differential expression of polymorphic killer cell immuno-

globulin-like receptors (KIRs) that recognize HLA class I

molecules.

5

Only recently has the KIR genomic region

been characterized to high resolution.

6

Consequently, re-

examination of diseases with long-established associations

with specific HLA polymorphisms is revealing a strong and

collective influence from KIR polymorphism.

7–10

The KIR locus in chromosomal region 19q13.4 is charac-

terized by unusually high diversity in the numbers of both

genes and their alleles.

11

The region varies in size from 100

to 350 kb as a result of structurally diverse haplotypes with

duplicated segments, large deletions, and gene fusions.

12,13

As a consequence of this plasticity, the 13 distinct KIR genes

(KIR2DL1 [MIM: 604936], KIR2DL2 [MIM: 604937],

KIR2DL4 [MIM: 604945], KIR3DL1 [MIM: 604946],

KIR3DL2

[MIM: 604947], KIR2DS1 [MIM: 604952],

KIR2DS2 [MIM: 604953], KIR2DS3 [MIM: 604954], KIR2DS4

[MIM: 604955], KIR2DS5 [MIM: 604956], KIR2DL5 [MIM:

605305], KIR3DL3 [MIM: 610095], and KIR3DP1 [MIM:

610604]) are combined in numerous ways. Haplotypes

have between 4 and 20 KIR genes, and the most common

KIR region haplotype has seven genes.

14

To varying degrees,

each KIR gene is polymorphic, and more than 600 KIR

alleles are currently defined.

15

KIR and HLA class I (HLA-A

[MIM: 142800], HLA-B [MIM: 142830], and HLA-C [MIM:

142840]) polymorphism are actively co-evolving,

16

sug-

gesting that many more KIR alleles and haplotypes await

discovery. During the last three decades, over 10,000 HLA

class I alleles have been characterized in specialized

clinical HLA laboratories,

15

and similar intensive study

will be needed for characterizing KIR diversity.

The function of an HLA class I molecule is to bind a pep-

tide, usually a nonamer, inside a cell and take it to the cell

surface, where the complex of peptide and HLA class I is

engaged by KIRs and other lymphocyte receptors.

17,18

On

healthy cells, the peptides bound by HLA class I molecules

derive from normal human proteins and do not stimulate

1

Departments of Structural Biology and Microbiology & Immunology, School of Medicine, Stanford University, Stanford, CA 94305, USA;

2

Department of

Neurology, School of Medicine, University of California, San Francisco, San Francisco, CA 94158, USA;

3

Illumina Inc., 5200 Illumina Way, San Diego, CA

92122, USA;

4

Division of Immunology, Department of Pathology and Cambridge Institute for Medical Research, University of Cambridge, Cambridge CB2

1QP, UK;

5

Immunogenetics and Transplantation Laboratory, University of California, San Francisco, San Francisco, CA 94143, USA;

6

UMR 7268 ADE´S, Aix-

Marseille Universite´, l’Etablissement Franc¸ais du Sang, Centre National de la Recherche Scientifique, 13344 Marseille, France

*Correspondence:

[e-mail]

http://dx.doi.org/10.1016/j.ajhg.2016.06.023

.

The American Journal of Human Genetics 99, 375–391, August 4, 2016

375

Ó 2016 American Society of Human Genetics.

---