VI
Summary
observed including a small divergence of the DRα and DRß helices normally adjacent
to the peptide N-terminus and an altered conformation of the conserved residue Valβ85
which partially opens up the P1 pocket. Overall, the DR1 structure seems to be
relatively stable even if three conserved hydrogen bonds are disrupted and small
conformational changes appear to destabilize the P1 anchor, which may facilitate
peptide release.
Peptide mobility in the MHC II peptide-binding groove was further investigated in
this study by NMR experiments and revealed the presence of multiple conformations
for MBP (myelin basic protein) peptide bound to DR2 molecule. These data advance
the structural understanding of MHC II/peptide complexes which is so far mainly
deduced from the static picture of crystal structures of MHC II/peptide complexes. The
NMR approach, including biosynthetic production of isotope-labeled MBP peptide and
subsequent loading onto DR2 molecules, resulted in high-quality NMR spectra and can
be used to further explore details about peptide dynamics in the MHC II/peptide
complex.
During this work, the established NMR system was applied to investigate peptide
release catalyzed by the small molecule J10 in solution. Although comparison of NMR
data before and after J10 addition revealed subtle changes in peak intensities, which
could indicate that the small molecule induces one of the peptide conformations, further
experiments are necessary to confirm this effect. The
19
F-NMR experiments performed
in this study revealed a higher affinity of the small molecule to low-stability
MHC II/peptide complexes than to high-stability complexes. This finding could direct
co-crystallization approaches of the small molecule that aim to identify its binding site
on MHC II molecules, which could in turn be important for further improvement of the
function of the therapeutically interesting J10.
VII
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Präsentation
antigener
Peptide
durch
Klasse
II
Moleküle
des
Haupthistokompatibilitätskomplexes (major histocompatibility complex, MHC) auf der
Zelloberfläche ist entscheidend für den Ablauf der adaptiven Immunantwort, die
Prozesse
wie
Antikörperproduktion,
Zellzerstörung
und
Initiierung
von
Regulationsmechanismen beinhaltet. Die Peptidbeladung und Ausbildung von stabilen
Peptid-MHC-Klasse-II-Komplexen wird katalysiert von HLA-DM (DM), ein
untypisches MHC-Klasse-II-Molekül. Ein Schwerpunkt dieser Doktorarbeit war es, den
molekularen Mechanismus des von DM katalysierten Peptidaustausches besser zu
verstehen, welches Bemühungen vorantreiben könnte, die Immunogenität bekannter
und neuer pathogener Organismen vorherzusagen. Desweiteren wurde der von einem
kleinen Molekül beschleunigte Peptidaustausch von MHC-Klasse-II-Molekülen
untersucht. Das synthetisch hergestellte kleine Molekül namens J10 hat Potential
therapeutisch angewandt zu werden, da es ermöglichen könnte, aktiv das präsentierte
Peptidrepertoire zu verändern, welches von Interesse ist für mannigfaltige medizinische
Anwendungen, wie z.B. verbesserte Effizienz von peptidbasierten Impfstoffen. Um den
dynamischen Prozess des Peptidaustausches zu untersuchen, welcher das Unterbrechen
und Wiederausbilden von vielfachen Peptid-MHC-Klasse-II Interaktionen beinhaltet,
wurden unterschiedliche Methoden angewandt, wie Röntgenkristallographie, NMR
Spektroskopie und Oberflächenplasmonresonanz.
Oberflächenplasmonresonanzexperimente in der Doktorarbeit demonstrieren, dass
DM an die stabilen Peptid-MHC-Klasse-II Komplexe DR1/HA und DR2/MBP bindet,
welche bis dahin keine oder nur geringe Empfindlickeit gegenüber DM gezeigt hatten.
Diese Ergebnisse unterstützen das Model eines gemeinsamen Übergangszustandes für
Peptid-MHC-Klasse-II Komplexe mit hoher und geringer Affinität, welcher abhängig
ist von kinetischen Parametern und bei höherer Temperatur häufiger vorkommt.
Desweiteren wurde in dieser Arbeit die funktionelle Bedeutung von den
Oberflächenplasmonresonanzexperimenten demonstriert, indem DM Bindung und DM
katalysierter Peptidaustausch von zwei Peptid-MHC-Klasse-II Komplexen mit hoher
und geringer Affinität verglichen wurden. DM Aktivität wurde mit Hilfe von
Fluoreszenzpolarisation gemessen und die Resultate beider Methoden zeigten gute
Übereinstimmung.
VIII
Zusammenfassung
Vorherige Studien haben gezeigt, dass die Loslösung des Peptid-N-Terminus
entscheidend ist, damit DM an MHC-Klasse-II Moleküle bindet, was wahrscheinlich
durch spontane Peptidbewegung möglich ist und auch durch SPR und NMR Daten in
dieser Arbeit unterstützt wird. Die Auswirkungen der partiellen Peptidloslösung auf die
MHC-Klasse-II Struktur waren jedoch unbekannt. In dieser Doktorarbeit wird die
Kristallstruktur eines DR1 Moleküls präsentiert, welches mit einer Variante des HA
(hemagglutinin) Peptids ohne die zwei N-terminalen Aminosäuren beladen ist und
somit einen Übergangszustand während der Peptidloslösung von MHC-Klasse-II
Molekülen darstellt. Erstaunlicher Weise weist die Struktur keine grossen, sondern
kleine konformationelle Unterschiede auf, wie z.B. ein geringes Auseinandergehen der
DRα und DRß-Ketten, die sich normalerweise neben dem Peptid-N-Terminus befinden,
und eine veränderte Seitenkettenkonformation von Valβ85, was zu einer teilweisen
Ӧ ffnung der P1 Tasche führt. Im Allgemeinen scheint die DR1 Struktur relativ stabil zu
sein, auch wenn drei konservierte Wasserstoffbrücken unterbrochen sind. Geringe
konformationelle Veränderungen scheinen die P1 Bindungstasche zu destabilisieren,
was eventuell die Peptidloslösung erleichtert.
Darueberhinaus wurde in dieser Arbeit die Peptidmobilität in der Bindungstasche
von Peptid-MHC-Klasse-II Komplexen mit NMR Experimenten untersucht welche die
Anwesenheit mehrerer Konformationen für das MBP (myelin basic protein) Peptid im
Komplex mit DR2 zeigten. Diese Daten geben ein besseres strukturelles Verständnis
des Peptid-MHC-Klasse-II Komplexes, welches bisher vor allem durch das statische
Bild von Kristallstrukturen beeinflusst ist. Der NMR Ansatz, welcher die
biosynthetische Produktion von isotopen-markiertem MBP Peptid und anschliessender
Beladung von DR2 Molekülen beinhaltet, ergab qualitativ hochwertige NMR Spektren
und kann angewandt werden, um weitere Details der Peptiddynamik in der
Bindungstasche zu untersuchen.
Das oben beschriebene NMR System wurde während dieser Arbeit angewandt, um
die von dem kleinen Molekül J10 katalysierte Loslösung des Peptids in Lösung zu
untersuchen. Obwohl der Vergleich von NMR Daten vor und nach J10 Zugabe geringe
Unterschiede von Signalintensitäten zeigte, welches bedeuten könnte, dass J10 eine
bestimmte Peptidkonformation induziert, sind weitere Experimente erforderlich, um
diesen Effekt zu bestätigen.
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F-NMR Experimente in dieser Arbeit zeigten höhere J10
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