The Impact of Intensive Fish Farming on Pond Sediment Microbiome and Antibiotic Resistance Gene Composition

Figure 1
). ArcMap
10.8.1 software was used for mapping and geo-spatial analysis.
Determination of Heavy Metal
Concentration
Sediment samples were dried at 110
◦
C to the constant mass,
then the particles of the 125
µ
m size were separated and
concentrations of HM (Heavy metals) were analyzed using X-
ray fluorescence spectrometer NITON XL2 Analyzer (2009). The
overall accuracy of chemical elements analyzed is between 10 and
20% for different chemical elements.
Frontiers in Veterinary Science | www.frontiersin.org
2
May 2021 | Volume 8 | Article 673756

---

Lastauskien ˙e et al.
Fish Farming Microbiome and Resistome
FIGURE 1 |
The sampling points in Simnas fishing ponds.
(A)
The location of Simnas fishery ponds in Lithuania,
(B)
The map of Simnas fishery ponds. Sample
collection points are indicated and named in the figure, as well as the legend for the bathymetry measurements.
Frontiers in Veterinary Science | www.frontiersin.org
3
May 2021 | Volume 8 | Article 673756

---

Lastauskien ˙e et al.
Fish Farming Microbiome and Resistome
Detection of Antibiotic Residues by
HPLC-MS
Antibiotic residues were extracted from the sediment samples
located in the main fishery pond and the exit areas, based
on the method described previously (
19
). The sediment
extracts were cleaned-up and concentrated using solid-phase
extraction SAX cartridges (Merck, Germany) and HLB cartridges
(Merck, Germany) in a tandem arrangement. The samples were
eluted with 10 ml of methanol. Finally, the eluted samples
were evaporated to dryness and dissolved in 1 ml of an
aqueous 40% methanol solution (v/v). The resulting sediment
extraction samples were analyzed using high-performance
liquid chromatography-mass spectrometry (HPLC-MS) system
(Shimadzu, Japan) equipped with a photodiode array (PDA)
detector (Shimadzu, Japan) and mass spectrometer (LCMS-2020;
Shimadzu, Japan) with an electrospray ionization (ESI) source.
The chromatographic separation was conducted using a YMC
Pack Pro column (3
×
150 mm; YMC, Japan) at 40
◦
C and a
mobile phase that consisted of 0.1% formic acid water solution
(solvent A) and acetonitrile (solvent B) delivered in the 5–
95% gradient elution mode. Mass scans were measured from
m/z 50 up to m/z 1,200 at a 350
◦
C interface temperature,
250
◦
C desolvation line (DL) temperature,
±
4,500 V interface
voltage, and neutral DL/Qarray, using N
2
as nebulizing and
drying gas. Mass spectrometry data were acquired in both
positive and negative ionization modes. The data were analyzed
using LabSolutions liquid chromatography-mass spectrometry
(LCMS) software.
Sediment Toxicity Bioassay
The acute luminescent bacteria test was performed in compliance
with ISO 11348-3:2007 using the
Aliivibrio fischeri
strain NRRL
B-11177. The composition of bacterial culture growth medium
and growth conditions were presented earlier (
20
). Biomass and
suspension of marine
A
.
fischeri
for luminescence measurement
was prepared as previously described (
21
). Sediment suspensions
(solid-phase), aqueous elutriates and respective serial dilutions
were prepared as described earlier (
22
). The exposure experiment
started after addition of 20
µ
l bacteria suspension to each well
containing 80
µ
l of prepared samples (sediment suspensions
or elutriate supernatants at different concentrations), control
(2% w/v NaCl) and reference chemical (3.5-dichlorphenol). The
effect of elutriate supernatants and sediment suspensions was
determined after 1 and 30 min, respectively, using microplate
reader Tecan Infinite M200 (Tecan Group Ltd., Männedorf,
Switzerland) at 20
◦
C. Three independent measurements were
conducted in duplicate. The level of luminescence inhibition in
exposed groups was expressed as percentage relative to control
according to formula: INH (%)
=
100
−
BL
S
/
BL
C
×
100; where
BL
S
bacterial luminescence after exposure to samples; and
BL
C
bacterial luminescence in control after respective incubation
time. Median effective concentration (EC
50
in mg dry weight/ml)
of sediment suspensions was obtained using Regtox software
(version EV7.0.5, Eric Vindimian, Paris, France). Since it was
not possible to derive EC
50
values for sediment elutriates it was
replaced by the inhibition value after 1 min exposure to undiluted
sediment elutriates corresponding to 75 mg dw sed./ml as
suggested earlier (
22
). Solid-phase EC
50
values were converted to
toxic units (TU) values as follows: TU
=
100/EC
50
. Samples were
classified using Persoone et al. (
23
) classification system. Toxicity
classes were determined according TU values estimated for solid-
phase and percentage effect (PE) for sediments elutriates. No
acute toxicity if PE
<
20; slight acute toxicity if PE
<
50; acute
toxicity if 1
≤
TU
<
10; high acute toxicity if 10
≤
TU
<
100;
very high acute toxicity if TU
≥
100.
DNA Extraction
Genomic DNA was isolated from sediment samples using
the ZymoBIOMICS
TM
DNA Miniprep Kit (Zymo Research,
USA) according to the manufacturer’s recommendations.
The concentration of extracted DNA was evaluated using a
biophotometer (Eppendorf, Germany). Four DNA extractions
were carried out for each sample. DNA was stored at
−
80
◦
C
until further analysis. PCR inhibition was tested using primers
Frrs/Rrrs (