Synthetic Biology Final Report

Synthetic Biology | State of the Art 
 
22 
e.g.  the  systematic  inactivation  of  each  individual  gene  present  in  a  genome.  Still,  all  these  methods  have 
limitations because they uncover several possibilities of misclassification of genes (Moya et al. 2009). 
The simplification of modern cells has also been approached in a third way, by searching for the biochemical 
description  of  well-defined  pathways  that  are  needed  to  perform  essential  functions.  Forster  and  Church 
(2006) described a minimal genome that contains just genes needed for informational processes but does not 
include  genes  for  intermediate  metabolism  (e.g.  lipid  metabolism  and  glycolysis),  representing  the  main 
component needed to synthesise a minimal self-replicative system. Self-reproductive vesicles that are defined 
in the minimal genome allow transmembranous small molecule transport. Such a system is entirely composed 
of genes with well-defined functions, which are designed by modules and allow a system-by-system debugging 
to attain self-replication. Moya et al. (2009) propose that this approach could be a good start to synthesise a 
useful, near-minimal, self-replicating system dependent on added energised substrates. 
Bacteria with small genome sizes (Moya et al. 2009): 
-
 
Mycoplasma genitalium: the 580kb genome is the smallest among organisms that can be grown as pure 
cultures, nevertheless it carries all essential genes for informational processes (replication, transcription, 
translation, and protein folding and processing) plus a severely limited metabolism. It still represents the 
smallest known genome of a bacterium that can be grown in the laboratory and therefore must be close to a 
minimal autonomous genome. 
-
 
Nanoarchaeum equitans is the only known archaeon exhibiting a symbiotic lifestyle. Its genome size is of 490 
kb presents a complete information-processing system and a highly simplified metabolic apparatus. 
-
 
Gammaproteobacteria, Buchnera aphidicola BCc and Candidatus Carsonella ruddii are three bacterial 
endosymbionts of insects with a very small microbial genome. Their role in their respective symbiosis is to 
supply the nutrients that lack in the insect host diet, mainly essential amino acids and vitamins. 
-
 
The smallest genome with 1.308 Mb of any cell known to replicate independently in nature corresponds to 
the photoheterotrophic marine bacterium Pelagibacter ubique. 
3.2.2
 
De novo construction of a cell – bottom-up approach 
Synthetic cells 
Contrary  to  top-down  applications,  the  bottom-up  approach  starts  from  scratch:  an  entity  is  built  by  self-
assembling  of  molecular  components  (Sole  et  al.  2007).  These  can  be  of  biological  nature  or  instead 
completely ad hoc chemical components. Another approach is the synthesis of a cell from its basic elements. 
Within  this  approach  the  comprehensive  understanding  of  three  essential  components  of  cellular  life  –  the 
DNA information, the compartment and the metabolism – is a prerequisite.  
The synthetic cell, built from scratch, is a unique compartment with a structure and an organisation similar to 
a  bacterium.  ATP  and  GTP  are  used  as  energy  sources  in  the  first  stages  of  the  development.  For  the 
information part, the synthetic DNA programmes would be  expressed with the  transcription and translation 
machineries extracted from an organism. The physical boundary of the artificial cell would be a phospholipid 
bilayer. Lipid bilayers are also the natural template for membrane proteins.  
The  cell  wall,  anchored  to  the  lipid  membrane,  provides  the  structural  strength  to  the  bacterium.  The 
fabrication  of  a  stable  compartment  with  an  active  interface  is  one  of  the  most  challenging  steps  in  the 
synthesis of a DNA-programmed artificial cell. The efficient insertion of membrane proteins into the bilayer is 
the  real  current  limitation  to  the  development  of  an  active  interface.  Membrane  proteins  can  be  also 
expressed and integrated into phospholipid bilayers (Noireaux et al. 2011).  

---

Synthetic Biology | State of the Art 
 
23 
A living organism is an open system made of hundreds of chemical reactions whose properties go beyond the 
DNA  programme.  A  continuous  uptake  of  energy  and  a  continuous  elimination  of  reaction  by-products  are 
critical for any living systems as well as for a synthetic cell. The construction of an artificial cell requires the 
development of an artificial environment. The external medium has to be an isotonic non-dissipative feeding 
solution  that  maintains  physiological  conditions  by  exchanges  of  low  molecular  mass  nutrients,  nucleotides 
and  amino  acids  through  the  phospholipid  membrane  (Noireaux  et  al.  2011).  Selective  exchanges,  osmotic 
pressure problems, and efficient transcription/translation are among the issues that must be solved to obtain 
an initial workable microscopic vesicle.  
Chassis 
By far the most common chassis in use is Escherichia coli. However, also other hosts as listed below are used.  
-
 
Escherichia coli: 
1.
 
Is  a  prominent  example  whose  genome  has  been  reduced  up  to  15%  in  various  projects  without  any 
noticeable effect on the investigated physiological properties (Heinemann and Panke 2006). 
2.
 
Has  the  advantage  of  the  availability  of  numerous  vectors  (plasmids,  cosmids,  BACs)  and  promoters  for 
heterologous  expression,  and  can  express  genes  with  G  +  C  codon  usage  as  high  as  73%,  but  does  not 
recognise promoters from Streptomyces (Zotchev et al. 2012). 
3.
 
Escherichia coli is one of the most common chassis used in synthetic biology because it can be grown easily 
and has relatively simple genetics which can be easily manipulated. Furthermore non-infective lab-strains 
can be constructed. 
4.
 
To date Escherichia coli is the best understood cellular life form; its genome has over four million base pairs 
of DNA and encodes about 5.000 genes (Glass 2012). 
Mycoplasma species: 
Mycoplasma genitalium has only 525 genes, about the tenth the number of genes encoded by Escherichia coli 
(Glass 2012). It has a very slow growth rate compared to e.g. Mycoplasma capricolum. Mycoplasma capricolum 
was  used  as  a  chassis  by  Gibson  et  al.  (2010)  for  the  transplantation  of  a  digitised  genome  sequence  of 
Mycoplasma mycoides. 
-
 
Bacillus subtilis: 
Bacillus subtilis can easily be manipulated in relation to genetic changes. It is sometimes used in the place of 
Escherichia coli because it has certain properties that are more amenable to some specific forms of genetic 
manipulation  related  to  synthetic  biology,  as  for  example  DNA  circuits  can  be  easily  integrated  into  the 
Bacillus subtilis genome (Zotchev et al. 2012). 
Minimum  genome  engineering  substantially  facilitated  the  optimisation  of  Bacillus  subtilis  as  a  production 
host. Bacillus species are mainly used to produce important enzymes (e.g. alpha-amylase) and biochemicals 
(e.g. biosurfactants) used in industry (Liu et al. 2013). 
Several Bacillus species have  evolved as an important  platform for the production of various enzymes  and 
chemicals.  A  vast  range  of  cellular  phenotypes  can  be  obtained  in  Bacillus  species  by  regulation  and 
modification  of  the  corresponding  metabolic  pathway  at  the  global  and  gene-specific  level.  The  genome 
sequence data of Bacillus species is available in specified databases (Liu et al. 2013). 
“Bacteria  have  the  functional  equivalent  of  an  immune  system  that  evolved  to  protect  them  from 
bacteriophages, the viruses that infect bacteria. The bacterial immune system is a complex of enzymes called 
restriction-modification  systems  that  enable  bacteria  to  recognise  and  destroy  foreign  DNA,  which  would 
usually come from an infecting bacteriophage. One of the enzymes is a methylase that chemically modifies 

---