Karakoç Z.,Ketani, M.A, Ketani,S .:
Mikroskopların Çalışma Mekanizması ve Çeşitleri
……………………………Dicle Üniv Vet Fak Derg 2016: :1(1):1-6
1
Mikroskopların Çalışma Mekanizması ve Çeşitleri
Zelal KARAKOÇ,
1
M. Aydın KETANİ,
2
Şennur KETANİ
3
1
Siirt Üniversitesi Veteriner Fakültesi Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı. Siirt
2
Dicle Üniversitesi Veteriner Fakültesi Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı. Diyarbakır
3
Dicle Üniversitesi Ziya Gökalp Eğitim Fakültesi Biyoloji Eğitimi Anabilim Dalı Diyarbakır
Özet
Temel tıp bilimleri ve biyolojide sistem, organ ve doku fonksiyonu hakkında bugün eriştiğimiz bilgi düzeyinin temeli, fonksiyonel birim
olan hücre ve yapıları hakkındaki bilgilerimiz nedeniyledir. Bu nedenle bilim insanları tarih boyunca, gözle göremedikleri bu mikro
evrendeki yapıları görünür hale getirip, deneysel bilgiler toplayabilmek için farklı büyütme araçları, mikroskoplar üretme çabasında
olmuşlardır.
Bileşik ilk mikroskop Janssen’in 16. yüzyılda ürettiği mikroskoptur. Ancak tarihte ilk mikroskop Hooke (1635-1703) tarafından
üretilmiştir. Hooke bir boru içine yerleştirdiği merceği ve oküleri, bir yağ lambası (ışık kaynağı) ve su dolu küre (kondensör) yardımıyla,
ince kesilmiş şişe mantarı dilimleri üzerine odaklayarak gördüğü yapıyı “hücre” olarak isimlendirmiştir. 1665 yılında Micrographia isimli
kitabını yayımlamıştır. Geçmişten günümüze tüm mikroskopların arasında görüntü itibariyle çok büyük farklar olmasına rağmen
görüntülemenin temel prensibini oluşturan fizik kanunları aynıdır. Bugün laboratuvarlarda görüntüleme amacıyla en sık ışık, elektron
demeti ve ultrases kullanan mikroskoplardan yararlanılmaktadır.
Anahtar Kelimeler:
Çalışma prensibi, görüntü, mikroskop.
Working Mechanism and Types of Microscopes
Summary
Basic medical sciences and systems biology, today we have reached the basic level of knowledge about organ and tissue function is due
to our knowledge of cell structure and functional unit. For this reason, scientists throughout history, they see eye to bring this micro-
structure in the universe becomes visible, different magnification tools to collect experimental data, it has become in the effort to produce
microscopes.
Janssen is the first compound microscope microscope produced in the 16th century. But the date on the first microscope Hooke (1635-
1703) was produced by. The lens puts into hooka pipe and ocular an oil lamp (light source) and water-filled sphere (condenser) with the
help of the structure seen by focusing on fine-cut cork slices "cell" has been termed. In 1665 the book was released Micrographia. As in
all past to the present microscope image, although very large differences in the underlying principles of the laws of physics are the same
view. The most common light display purposes in laboratories today are utilized microscope uses an electron beam and ultrasound.
Key Words:
image and microscope, Working prencipal,
GİRİŞ
Beyaz
ışık,
elektromanyetik
dalga
spektrumun gözümüzün görebildiği 400-800 nm
arasındaki kısmına karşılık gelmektedir. Görünebilir
spektrumdan daha küçük dalga boyundaki ışık ışını
ultraviyole, daha büyük dalga boyundaki ise infra-red
spektrumunda yer alır. Farklı maksatlarla tüm bu
dalga spektrumlarının seçilmiş bir bandı veya tek
dalga boyuna sahip ışık ışınları kullanılmaktadır (1).
Büyütmenin en bilinen aracı büyüteçtir. Burada
objeden yansıyan paralel ışık ışınları lensten geçerek
odak noktasına kırılır ve retinada görüntü oluşur.
Görüntünün boyu lensin arkasında oluşan büyütülmüş
sanal
görüntüye
ait
olduğundan
büyütme
gerçekleşmiş olur. Mikroskoptaki fizik prensipler
özünde büyüteçtekine benzemekle birlikte bazı farklar
arz eder. Mikroskopta ambient ışık yerine belli bir
ışık kaynağı kullanılır. Aydınlatma ışığı bir
kondensör (yoğunlaştırıcı) lens yardımıyla numuneye
odaklanır. Numuneden geçen ışık ışınları (transmitted
light) objektif lens tarafından birinci defa büyütülür.
Elektronik:ISSN:
1308-0679
http://www.dicle.edu.tr/veteriner-fakultesi-dergisi
http://www.dicle.edu.tr/fakulte/veteriner/dergi.htm
DERLEME
Karakoç Z.,Ketani, M.A, Ketani,S .:
Mikroskopların Çalışma Mekanizması ve Çeşitleri
……………………………Dicle Üniv Vet Fak Derg 2016: :1(1):1-6
2
Oluşan görüntü paralel ışık demetleri halinde
mikroskop tüpünden okülere ulaştıktan sonra ikinci
büyütmeye uğrar, odağa kırılan ışık demetleri gözlem
planında final görüntüyü oluşturur. Oluşan görüntü
aslında iki kez büyütülmüş sanal görüntüye ait
olduğundan numunenin yeterince büyük bir
görüntüsünü gözlemek mümkündür. Bu yöntemle
numunenin 1,000 kez büyütülmüş görüntülerini elde
etmek mümkündür (1, 2, 3).
Mikroskoplarda görüntü numunenin ışığın yansıma,
kırılma, transmisyon ve absorbsiyon, interferens,
polarizasyon, difraksiyon ve floresansı indükleme
özelliklerinde yararlanılarak elde edilir. Klasik ışık
mikroskobu ile şiddet kontrastı, faz kontrastı,
modülasyon
kontrastı,
interferans
kontrastı
yöntemleri ile örneğin farklı vasıflarını ön plana
çıkartan görüntülerini elde mümkündür (4).
Şekil- 1: Canlı hücrelerin ışık mikroskobu ile faz-kontrast mikroskobu arasındaki görüntü farkı.
(
www.google.com.tr/search?q=faz+kontrast+mikroskobu+görüntüleri&espv=2&biw=1366&bih=667&sour
ce=lnms&tbm=isch&sa=X&ved=0ahUKEwj0l9z1vdjKAhWDCSwKHTaVBkkQ_AUIBigB#tbm=isch&q=
cell+of+phase+contrast+microscopy&imgrc=PrcSzcqMLz3IyM%3A
)
1-Yansıma
Stereomikroskop,
taramalı
elektron
mikroskobu (SEM) gibi mikroskoplar; objeden
yansıyan ışınları kullanarak büyütülmüş görüntü
oluştururlar (4).
2-Kırılma
Işık farklı kırma indisine sahip (farklı
yoğunlukta) bir ortamdan diğerine geçerken kırılır.
Işık dalgalarının iki farklı ortamda değişik hızlara
sahip olmaları, ışığın doğrusal hareketinde sapmalara
neden olur. Işığın kırılma özelliği merceklerin
fonksiyonunda yatan bir özelliktir ve mikroskopinin
her türünde kullanılır (2, 4).
3-Transmisyon-Absorbsiyon
Bir objeden geçen ışığın amplütüdünün
azalması olayına absorbsiyon denir. Işık cam gibi
transparanlardan geçer, buna da transmisyon denir.
Bu özellikler biyolojik optik mikroskopide görüntü ve
kontrast elde etmede kullanılır (4).
4-Polarizasyon
Işığın polarize olması doğal bir özelliğidir ve
bu özellik mikroskopide arttırılarak kullanılır. Bir ışık
demeti değişik frekanslarda dalgalar içerir ve bunlar
arasında olası faz ilişkileri ve her düzlemde titreşim
görülebilir. Işık dalgalarının titreşimi yalnızca bir
düzlemde kısıtlanırsa buna polarize edilmiş düzlem
denir (4).
5-İnterferens
Transparan objeler, içinden geçen ışığın
fazını değiştirirler (yavaşlarlar). Bu faz değişikliği
dalgaların girişim özelliği ile amplitüd değişikliğine
dönüşebilir. Eşit amplitüdlü iki ayrı dalga, eşit fazda
iseler; amplitüdü orjinalin iki katı olan bir dalga
oluşumu ile sonuçlanır. Ters fazlı iseler; girişim
sonucu birbirini söndürür ve amplitüdü 0 olur. Bu
özellik faz-kontrast mikroskopide kullanılır (2,4).
6-Difraksiyon
Işık ışınları bir engelin kenarından,
köşesinden ya da bir delikten (ışığın dalga boyundan
küçük veya eşit) geçerken bu engel etrafında kırılma
ve dağılma özelliğine sahiptir. Işığın difraksiyon
özelliği optik aletlerde çözümleme gücünü etkiler. Bu
özelliğe göre mikroskoplarda kullanılan ışık
kaynağının dalga boyu ve ışığın geçmesini sağlayan
apertürlerin çapı yapım sırasında dikkate alınarak en
iyi resolüsyona ve kontrasta ulaşılmaya çalışılır (2,4).
7-Floresansı İndükleme
Floresans bazı maddelerin sahip olduğu bir
özelliktir. Bu maddeler belirli dalga boyundaki ışığı
absorbe edip, daha uzun dalga boyunda ışık olarak
tekrar yayarlar. Ultraviyole gibi görme sınırımız
dışında kalan bir ışık floresan bir madde tarafından
absorbe edilip, görülebilen ışık spektrumu içinde bir
dalga boyunda yansıtıldığında, görülebilir (2,4).
Karakoç Z.,Ketani, M.A, Ketani,S .:
Mikroskopların Çalışma Mekanizması ve Çeşitleri
…………………..…Dicle Üniv Vet Fak Derg 2016: :1(1):1-6
3
MİKROSKOP ÇEŞİTLERİ
1-Stereomikroskop
Sadece yüzey özelliklerini incelemede kullanılır. Özellikle kriminal laboratuvarlarında, İn vitro
fertilizasyon uygulamalarında, Preparat hazırlık aşamasında dokuların küçültülmesinde kullanılır (4).
2-Aydınlık Alan Mikroskobu
Işık mikroskobunun klasik görüntüleme tekniğidir. Preparat kondansör tarafından üretilen ve
alttan gelen ışık demeti ile aydınlatılır. Kontrasttan zengin preparatlar bu teknikte iyi sonuç verebilir (3,4).
3-Karanlık Alan Mikroskobu
Ayna kondansörler kullanılır. Örneğe gelen merkez ışınlar engellenirken yalnızca oblik gelen
ışınlar yansıtılır. Böylece örneğin sadece parlak olan kenarları izlenir. Hücre süspansiyonlarında
hücrelerin (bakteri, protozoa) görüntülenmesinde, hücre kültürlerinde hareketlilik tespitinde,
Otoradyografi uygulanmış preparatların incelenmesinde (İn situ hibridizasyon), sıvılarda içerik
incelenmesinde ve genellikle boyanmamış örneklerin görüntülenmesinde kullanılır (4).
Şekil-2: Ok: Alyuvarların Karanlık Alan Mikroskobundaki Görünümü.
(
http://microscopegenius.com/microscope-basics/compound-microscopes/darkfield-
microscopes/
)
4-Faz-Kontrast Mikroskobu
Işığın farklı kırılma indisine sahip
hücre ve hücre dışı yapılardan geçerken hızını
ve yönünü değiştirmesine (faz-kontrast farklılığı
yaratılmasına)
dayanır.
Faz-kontrast
mikroskobunda görüntü iki türlüdür (4).
4.1-Pozitif (karanlık) faz-kontrast; örnek
detayı, aydınlık geri plan üzerinde koyu yapılar
olarak izlenir.
4.2-Negatif (aydınlık) faz-kontrast; örnek
detayı, karanlık geri plan üzerinde parlak yapılar
olarak izlenir.
Faz kontrast mikroskobu genellikle
boyanmamış canlı hücrelerin incelenmesi, hücre
içi yapıların incelenmesi, yüksek büyütmelerde
detay incelemesi ve silia, filagellum gibi
membran farklılanmalarının incelenmesinde
kullanılır.
Şekil-3: Bacillus anthracis sporlarının faz kontrast mikroskobu altındaki görünümü.
(
http://www.mayo.edu/research/centers-programs/translational-immunovirology-biodefense-
program/overview
)
Karakoç Z.,Ketani, M.A, Ketani,S .:
Mikroskopların Çalışma Mekanizması ve Çeşitleri
…………………..…Dicle Üniv Vet Fak Derg 2016: :1(1):1-6
4
5-Diffarensiyel
İnterferans
Kontrast
Mikroskobisi (DIC)
Nomarski tarafından 1950’li yıllarda
tanımlanan, örnekteki değişik optik gradyanları
belirleme ve bunları değişik ışık yoğunluklarına
çevirebilme yöntemini kullanır. Yapıların
kimyasal ajanlar (boyalar) yerine optik özellik
kullanılarak görülür hale getirilmesi söz
konusudur. Gelen ışık kondansörün altındaki bir
polarizörden geçirilerek tüm ışın demetlerinin
polarize olması sağlanır. Buradan çıkan
demetler bir prizmadan (Wollaston prizması)
geçirilmek suretiyle iki farklı ışın demeti şekline
dönüştürülür. Bu demetler birbirine yakın olarak
ilerlerler. Örnekteki farklı yapılar tarafından
hızının yavaşlaması ya da refraksiyonu
nedeniyle bu iki ışın demetinin ilerlemesinde
farklılıklar ortaya çıkar. Objektife gelen ışınlar
ikinci bir prizma ve onu takiben analizörden
geçerek göze ulaşır (4).
6-Polarizasyon (Kutuplaştırma) Mikroskobu
Polarizasyon mikroskobu incelenen
cisimlerin optik anizotropik özelliğinden
yararlanarak görüntülenmesi için kullanılır.
Yapıların sahip olduğu çift kırılma özelliğinden
yararlanır. Kutuplaştırıcı bir filtreden geçen
normal ışık sadece bir yönde titreyerek çıkar.
Bu filtrenin üzerine ikinci bir filtre, ana ekseni
ikinci filtreye dik olacak biçimde yerleştirilir ve
böylece karanlık alan etkisi oluşur. Polarize
edici iki filtre arasına belirli bir yöne doğru
yönlenmiş molekül içeren doku yapıları
yerleştirilirse belli düzende yinelenen yapılar
polarizörden çıkan ışığın eksenini saptırırlar.
Sonuçta koyu zemin üzerinde bu yapılar parlak
görünür (4).
7-Floresan Mikroskobu
Belli floresan maddeler uygun (kısa)
dalga boyundaki ışık altında tutulduğunda daha
uzun dalga boyundaki ışık yayarlar. Floresan
mikroskopta doku kesitleri morötesi (ultraviyole
360 nm, mavi ışık 400 nm ) ışık altında tutulur.
Civa buharlı lambalar, ksenon gaz lambaları
kullanılır. Floresan maddeler karanlık bir zemin
üzerinde parlak ışıltılı parçacıklar şeklinde
izlenir. Floresan mikroskoplarda, arzu edilen
dalga boyundaki yansımanın görüntülenebilmesi
için, bazı filtreler kullanılır. Işık kaynağının
önünde objeye ulaşacak dalga boyunu seçen bir
filtre, objektiften sonra kısa dalga boyunun göze
ulaşmasını önleyen bir filtre yerleştirilmiştir (5).
Moleküler düzeyde hücre ve doku
içeriğinin belirlenmesi (örnek Akridin turuncusu
ile boyanmış preparatlarda DNA ve RNA’nın
hücre
içi
konumu),
maddelerin
hücre/dokulardaki yoğunluğunun belirlenmesi,
ışık mikroskobik boyama yöntemleriyle ayırt
edilemeyen
hücreler
ve
hücre
içi/dışı
elemanların gösterilmesinde kullanılır (4).
Şekil-4: Hücre bölünmesi sırasında DNA mavi, proteinler yeşil, mikrotubullerin kırmızı olarak
göründüğü floresan mikroskop görüntüsü
(
https://en.wikipedia.org/wiki/Fluorescence_microscope
)
8-
Karakoç Z.,Ketani, M.A, Ketani,S .:
Mikroskopların Çalışma Mekanizması ve Çeşitleri
…………………..…Dicle Üniv Vet Fak Derg 2016: :1(1):1-6
5
Konfokal Mikroskobu
Konfokal mikroskopi hücre araştırmaları
için ideal bir araştırma yöntemidir. Ancak doku
parçalarında kullanımı nispeten kısıtlıdır. Uyarı
ışığının derindeki hücreye penetrasyonu ve
floresan emisyonun dokuda yayılımı zor
olduğundan yüksek enerji kullanılması gerekir.
Yüksek enerji doku ve hücreye zarar
vereceğinden canlı yapılarda uygun değildir (1,
6).
Lazer ışını örnek üzerine düşürülür. Odak
planındaki yapıdan (örnekten) emisyon yayılır.
Emisyon ışın dikroik aynadan yansır ve pin-
hole’den geçer. PMT (foton çarpıcı)’lar
tarafından sayılır. Voltaj sinyali olarak saklanır
ve digital ortamda kaydedilir. Görme alanı
piksellere ayrılır, her piksel sırayla lazerle
taranır. Konfokal mikroskobunda Soğurma
Geçişinin (Pin-Hole) önemli bir yeri vardır.
Görüntü düzlemi önüne konan pin-hole filtre
görevi görür ve odak dışı yansıyan ışığın
geçmesine izin vermez. Odak alanı içindeki ışık
geçirildiğinden bu sayede sadece görmek
istediğimiz alan netleşir (4).
Canlı hücre görüntüleme, GPF (yeşil
florasan protein) kullanılarak hücre ve doku içi
protein tarfiğini görüntüleme, floroformlarla
işaretlenebilen protein, gen gibi yapıları ve
onların hareket ve pozisyonlarını görüntüleme,
Hibridizasyon
ve
florasan
PCR’ın
de
kullanıldığı
kromozom
üzerindeki
gen
lokalizasyonunu
saptamada,
Subselüler
fonksiyonu analiz etmede kullanılan mikroskop
türüdür (4, 6).
9-Elektron Mikroskobu
Elektron
mikroskobu
(EM)
görüntü
oluşturmak için ışıktan daha çok elektronları
kullanan bir mikroskoptur (7).
Elektron mikroskobu yüksek çözümleme
gücü ile incelemeye olanak veren bir
görüntüleme sistemidir.
İnsan gözünün ayırt etme gücü 0.1
mm
Işık mikroskobunun ayırt etme
gücü 0.2 μm
Elektron Mikroskobunun ayırt
etme gücü 0.1 nm’dir.
EM’nun, Transmission Electron Microscopy
(TEM) ve Scanning Electron Microscopy
(SEM) olmak üzere iki temel tipi vardır. Daha
az
kullanım
alanına
sahip
Scanning
Transmission Electron Microscopy (STEM)’da
üçüncü tipi olarak bilinmektedir (3, 7, 8).
9.1-Transmisyon Elektron Mikroskobu
Bu
mikroskop
türünde
kullanılan
elektronlar vakum ortamında metal bir flamanın
yüksek derecede ısıtılmasıyla elde edilir.
Elektronlar salıverildikten sonra anot ile katot
arasında gerilime sokulur ve böylece ivme
kazanarak hızlanırlar. Anodun merkezindeki
açıklıktan geçip tüpün içerisine girerek
kesintisiz bir elektron demeti oluştururlar. Bu
demet elektrik bobinleri (elektro manyetik
mercek) tarafından saptırılır. Bazı elektronlar
kesitteki atomlarla etkileşime girerek yoluna
devam ederken, diğerleri etkileşmeksizin
örneğin içinden geçer. Elektronların büyük
bölümü objektife ulaşır. Görüntü son aşamada
floresan bir ekrana ya da fotoğraf plakalarına
veya elektronik kameraya düşürülür. Elde
edilen görüntü siyah beyazdır. Görüntüdeki
koyu alanları elektron yoğun, açık renkli alanlar
ise elektron geçirgen olarak adlandırılır (4,7).
9.2-Tarama Elektron Mikroskobu
Bu mikroskop, örnek üzerinde bir
noktadan sırayla hareket ettirilen çok ince bir
elektron demeti oluşturur. Elektronlar örnek
içinden geçmez, daha önceden doku üzerine
kaplanan ince bir metal tabaka üzerine çarpar ve
yansır. Bu elektronlar bir algılayıcı tarafından
yakalanarak yükselticilere gönderilir ve oluşan
sinyallerde monitöre aktarılır (4, 7).
Hücre içi organellerin yapıları, organellerin
hücre içindeki dağılımı, organellerin diğer
organeller
ile
komşuluğu,
organellerin
fonksiyonel
ilişkileri,
çekirdeğin
yapısı,
membran
bütünlüğü,
membrandaki
değişiklikleri,
dokuların
organizasyonunun
ortaya konmasında kullanılır. Bunların dışında;
patolojik durumların tespitinde de kullanım
olanağı bulunmaktadır. Şöyle ki;
Renal
biyopsilerin
değerlendirilmesi:
Glomerüler bozukluklar, bazal membran
kalınlaşmaları, mezangial değişiklikler, immun
kompleks birikimleri,
Doğru
tümör
tanısı:
Tümörlerin
tiplendirilmesi
ve
evrelendirilmesi,
metaztazlarda primer odağın belirlenmesi,
çeşitli nöroendokrin tümörlerin tanınması,
lenfomalar,
Doğumsal
bazı
metabolizma
bozukluklarının tanınması: Glikojen depo
hastalıkları, mukopolisakkaridozlar, lipidozlar,
ailesel depo hastalıkları,
Virus gibi enfeksiyon ajanlarının dokularda
tanınması:
herpes
simpleks,
legionella
pneumophila, Whipple hastalığı, Bazı deri
hastalıkları:
Bülloz
dermatitler,
kutanöz
amiloid, viral deri lezyonları, saç telinin SEM
incelemesi, histiositozis X, v.b.
Ca, Mg, Na, Zn ve K gibi hücre içi iyon
konsantrasyonu
değişimlerini
ölçmede
kullanılır.
Karakoç Z.,Ketani, M.A, Ketani,S .:
Mikroskopların Çalışma Mekanizması ve Çeşitleri
…………………..…Dicle Üniv Vet Fak Derg 2016: :1(1):1-6
6
Şekil-5: Schwann hücresi (Maymun) elektron mikroskop görüntüsü.
(
www.uni-mainz.de/FB/Medizin/Anatomie/workshop/EM/EMKernE.html
)
Kaynaklar
1-Pural N. (2004). Fonksiyonel hücre görüntüleme
teknikleri. Hacettepe Tıp Dergisi 35:107-113.
2- Doğan E ve Çetin M. Mikroskopik Görüntüler
için İçkin Görüntü Hesaplaması ve Görüntü
Bulanıklığının
Giderilmesi.
Erişim:
www.researchgate.net/publications
.
Erişim tarihi:
04.10.2014.
3- İşçi C. (2008). Cisimleri nasıl ve ne kadar
ayrıntılı görebiliriz? Resim ve görmede çözünürlük.
Journal of Yasar University, 3(11), 467-477.
4- Junqueria LC ve Carneiro J. (2006). Temel
Histoloji. 2. Basım. Nobel Yayınevi, Ankara.
5- Herman B. (1998). Fluorecence microscopy. 2th
Edition
.
New York, Berlin, Heidelberg: Springer
Verlag.
6- Paddock S. (1998). Confocal microscopy
.Methods in molecuar biology Volume 122.
Humana Press.
7-Kapakin K. (2007). Transmission Elektron
Mikroskobu. Yyü Vet Fak Derg.18(1):105-110.
8- Bozzola JJ and Russell LD. (1998). Electron
Microscopy
Principles
and
Techniques
for
Biologist.
2th
Edition.
London.
Yazışma Adresi:
Yrd. Doç. Dr.Zelal KARAKOÇ
Siirt Üniversitesi Veteriner Fakültesi
Merkez Kampüs 56100 SİİRT
Faks: 0 484 223 86 78
e-mail:zelalkarakoc@siirt.edu.tr
Dostları ilə paylaş: |