Loviyadan nukleoproteidlarni ajratish

Loviyadan nukleoproteidlarni ajratish

Ishning umumiy izohi. Fenol – detergent yordamida loviya kurtagidan umumiy RNK ajratib olinib, uning tozalik darajasi va unumini aniqlash.

Jihozlar va reaktivlar. Sentrifuga, hovoncha, aralashtirgich, 50 ml li o‘lchov silindri, 10 ml li pipetka yoki 10-20 ml li shpritslar, standart tuzli eritma 0,14 M Na (K)-sitrat, 200 ml etil spirti, suvga to‘yingan fenol, pH 6,0 li 10% Na-dodetsilsulfat (Na- DDS), xloroform, izoamil spirti, 5 g ungan loviya.

Ishning borishi. Loviyaning unib chiqqan qismini vodoprovod suvi bilan va keyin distilangan suv bilan yaxshilab yuviladi. Undan 5 g olib, chinni hovonchada 50 ml standart tuzi eritmada gomogen holatga keltiriladi va gomogenatni 3-4 qavatli dokadan o‘tkaziladi. Bu gomogenatga 1% gacha Na-dodetsilsulfat qo‘shiladi va aralashtiriladi va uning ko‘pirib ketmasligiga e’tibor berib, suvga to‘yintirilgan pH 6,0 fenol qo‘shiladi. Aralashmani 60 ⁰C gacha qizdiriladi va 30 minut davomida yaxshilab chayqatiladi, 0 ⁰C- +5 ⁰C atrofida sovutiladi va 15-20 minut davomida sentrifugalanadi. Bunda 3 ta qavat hosil bo‘ladi: suvli, fenol va cho‘kma. Suvli qatlam deproteinlashga uchragan RNKdan tarkib topgan, uni shprits yordamida ajratib olinadi va teng hamdagi xloroform va izoamil spirti aralashmasi (24:1) bilan deproteinlanadi. Aralashmani fenol bilan ishlanganidek yaxshilab chayqatiladi, sentrifuga qilinadi va yuqoridagi suvli qavat ajratib olinadi. RNK suvli qavatdan 2,5 hamdagi spirt bilan cho‘ktiriladi (-10 ⁰C). Sentrifuga yordamida cho‘kmani ajratib olinadi va 10-20 ml standart tuzi eritmada eritiladi yoki boshqa bufer eritma ishlatish mumkin va 260, 280 va 230 nm da yutilish qiymatlari aniqlanadi. A260/A230 va A260/A280 aniqlanadi. Birinchi nisbat RNKning polisaxaridlardan, ikkinchisi oqsillardan tozalanish darajasini belgilaydi (≥2,00). 260 nm dagi yutilish yordamida RNK konsentratsiyasi va hosil bo‘lgan miqdori aniqlanadi (260 nm dagi 1 optik birlik qiymatga 42 mkg RNK to‘g‘ri keladi).